微量量热法研究细菌对头孢曲松钠和钩藤碱的耐药性

耐药菌的危害已遍及全球 ,耐药性问题成为世界性的新的研究热点[1] ,近年来 ,研究细菌的耐药性大部分采用纸片扩散法、肉汤稀释法和琼脂稀释法 .用微量量热法研究细菌的耐药性尚未见报道 ,本文用新型热活性检测仪 (3114 /32 36TAMAir)测定了不同浓度的头孢曲松钠、钩藤碱对大肠杆菌的热功率—时间曲线 ,即Pt-t曲线 ,用logistic模型处理曲线得到了生长速率常数 ,并建立了生长速率常数与药物浓度的关系 ,确定了最小抑菌浓度 ,然后取原始菌在各自的亚抑菌浓度 (比最小抑菌浓度稍低的浓度 )下培养耐药菌 ,连续传代 10次即 10代 ,然后用热活性检测仪测出在其亚抑菌浓度作用下的每一代耐药菌生长代谢的热功率—时间曲线 ,用logistic模型处理该曲线的指数生长期得出每一代耐药菌的生长速率常数 ,确立了生长速率常数与传代次数之间的关系 ,并将细菌对中药钩藤的耐药性和细菌对西药头孢曲松钠的耐药性作了对比 .1　实验部分1.1　实验仪器瑞典ThermalMetricAB公司生产的新型微量量热仪 (3114 /32 36TAMAir) ,该仪器热稳定性能好 ,可输出 10 - 5W的功率 ,2 4h基线漂移不超过 2× 10 - 5W ,恒温工作范围为 5℃～ 6 0℃ ,可维持± 0 .0 2℃不变 ,测量范围 6 0mW和 6 0 0mW两档 ,最大样品体积 2 4mL .1.2　试剂氨水 ;乙醇 ;乙醚 ;盐酸 ;硫酸钠等均为分析纯 .大肠杆菌由山东省卫生防疫站提供 .采用牛肉膏汤液体培养基 ,其成分为蛋白胨 2g ,氯化钠 2g ,牛肉浸膏 1g ,蒸馏水 2 0 0mL ,调pH值至 7.2～ 7.4 ,过滤后分装在洁净试管中 ,每只盛 8mL ,然后用 12 1℃蒸汽灭菌 30min ,冷却后置冰箱中备用 .1.3　头孢曲松钠和钩藤碱液的制备头孢曲松钠由上海新先锋制药厂生产 ,钩藤碱的提取按文献[2 ] .取头孢曲松钠 0 .0 0 16g溶解于 10 0mL无菌水中得头孢曲松钠溶液备用 ,取钩藤碱 0 .0 183g溶于10 0mLDMF试剂中得钩藤碱溶液备用 .1.4　耐药菌的培养取原始菌在各自的亚抑菌浓度下培养 ,培养条件为 37℃下培养 12h ,12h后接菌到同样浓度的药液中再在同条件下培养 ,每培养一次称一代 ,传代10次即 10代 .1.5　实验方法本实验采用安瓶法 ,打开仪器 ,当仪器稳定在37℃并且基线稳定后 ,将安瓶放在灭菌台上消毒 15min ,然后取一只培养基接菌并全部倒入安瓶中 ,封口放入仪器中 ,并开始记录数据 ,当细菌代谢的热功率—时间曲线返到基线时即认为实验结束 .1.6　交叉耐药性测定用钩藤碱液作用于在头孢曲松钠液中培养的耐药菌 ,反过来 ,用头孢曲松钠液作用于钩藤碱液中培养的耐药菌 .2　结果与讨论本文测定了 37℃时 ,不同浓度的头孢曲松钠与钩藤碱对大肠杆菌代谢作用的热功率—时间曲线和在亚抑菌浓度作用下的各代耐药菌代谢作用的热功率—时间曲线 ,部分曲线见图 1～图 4 .图 1　用头孢曲松钠培养的第t代耐药菌代谢作用的Pt-t曲线图 2　头孢曲松钠对大肠杆菌代谢作用的Pt-t曲线2 .1　大肠杆菌在不同浓度的头孢曲松钠作用下的生长速率常数及最小抑菌浓度根据头孢曲松钠对大肠杆菌代谢作用的热谱曲线上的数据 ,处理细菌的指数生长期 ,计算出了大肠杆菌在不同浓度头孢曲松钠下的生长速率常数 ,生长速率常数的计算见参考文献 [3].根据生长速率常数μ与头孢曲松钠浓度c的数据 ,拟合 μ -c曲线 ,见图 5 ,建立 μ -c的关系为 μ =0 .0 32 11- 0 .0 0 4 5 5c(r=0 .9979) ,由图 5可知头孢曲松钠对大肠杆菌的代谢作用是抑菌的 .求出头孢曲松钠对大肠杆菌代谢作用的最小抑菌浓度为 7.0 5 71× 10 - 8g/mL .取亚抑菌浓度为 3.990 0× 10 - 8g/mL来培养耐药菌 .图 3　钩藤碱对大肠杆菌代谢作用的Pt-t曲线图 4　用钩藤碱培养的第 10代耐药菌代谢作用的Pt-t曲线图 5　头孢曲松钠对大肠杆菌代谢作用的 μ -c曲线2 .2　大肠杆菌在不同浓度的钩藤碱作用下的生长速率常数及最小抑菌浓度根据钩藤碱对大肠杆菌代谢作用的热谱曲线上的数据 ,处理细菌的指数生长期 ,计算出了大肠杆菌在不同浓度钩藤碱下的生长速率常数 .根据生长速率常数 μ与钩藤碱浓度c的数据 ,拟合 μ -c曲线 ,如图 6 ,建立 μ -c的关系为 μ =4 .15 2 4 3c3- 12 .0 16 6 5c2 + 11.5 16 6 3c - 3.5 86 81(c <1.0 0 1× 10 - 6 g/mL)r =0 .9999,μ =0 .16 0 2 2 -0 .0 9375c(1.0 0 1× 10 - 6 g/mL <c <1.2 72× 10 - 6 g/mL)r =0 .9998,由图 6可知钩藤碱是先促菌后抑菌 ,最佳促菌浓度为 0 .8871× 10 - 6 g/mL ,最小抑菌浓度为 1.70 90× 10 - 6 g/mL ,取亚抑菌浓度 1.6 32 3×10 - 6 g/mL来培养耐药菌 .图 6　钩藤碱对大肠杆菌代谢作用的 μ -c曲线2 .3　头孢曲松钠溶液中的传代菌对头孢曲松钠耐药性的测定用微量量热仪测出各代耐药菌在头孢曲松钠的亚抑菌浓度 (3.990 0× 10 - 8g/mL)下的热功率—时间曲线 ,处理细菌生长的指数生长期 ,计算出各代耐药菌的生长速率常数 ,根据生长速率常数 μ与传代次数n的关系 ,拟合 μ -n曲线 ,建立 μ -n的关系式见表 1.表 1　生长速率常数与传代次数的关系药液方程范围R头孢曲松钠 μ =0 .0 43 3 7+ 0 .0 0 13n 1≤n≤ 40 .9912μ =0 .0 3 2 71+ 0 .0 0 3 99n 5≤n≤ 10 0 .9989钩藤碱 μ =0 .0 42 1+ 4.83× 10 - 4n 1≤n≤ 40 .9946μ =0 .0 3 92 5 + 0 .0 0 12 3n 5≤n≤ 10 0 .99412 .4　钩藤碱溶液中的传代菌对钩藤碱耐药性的测定用微量量热仪测出各代耐药菌在钩藤碱的亚抑菌浓度 (1.6 32 3× 10 - 6 g/mL)下的热功率—时间曲线 ,处理细菌的指数生长期 ,计算出了大肠杆菌在不同浓度钩藤碱作用下的生长速率常数 ,根据生长速率常数 μ与传代次数n的关系 ,拟合 μ -n曲线 ,建立 μ -n的关系式见表 1,细菌对头孢曲松钠和钩藤碱产生耐药性趋势的比较见图 7.图 7　细菌对头孢曲松钠和钩藤碱的耐药性比较1.头孢曲松钠　 2 .钩藤碱2 .5　交叉耐药性测定根据钩藤碱对头孢曲松钠培养的第十代耐药菌和原始的大肠杆菌代谢作用的热功率—时间曲线与头孢曲松钠对钩藤碱培养的第十代耐药菌和原始的大肠杆菌代谢作用的热功率—时间曲线 ,处理细菌的指数生长期 ,计算出相应的生长速率常数见表 2 .表 2　交叉耐药性比较头孢曲松钠钩藤碱菌种 μ 菌种 μ钩藤碱培养 0 .0 492 7头孢曲松钠培养 0 .0 4692的第十代耐药菌的第十代耐药菌原始的大肠杆菌 0 .0 4989原始的大肠杆菌 0 .0 465 42 .6　结论(1)　比较方程 μ =0 .0 4 337+ 0 .0 0 13n和方程μ =0 .0 32 71+ 0 .0 0 399n的斜率知 0 .0 0 399>0 .0 0 13,比较方程 μ =0 .0 4 2 1+ 4 .83× 10 - 4n和方程 μ =0 .0 392 5 + 0 .0 0 12 3n的斜率知 0 .0 0 12 3>4 .83×10 - 4,细菌对两种药耐药性的规律可以看出从第 4代耐药菌之后耐药性产生加快 ,细菌对药物的敏感程度越来越低 ,这为临床用药提供了理论基础 .比较方程 μ =0 .0 32 71+ 0 .0 0 399n和方程 μ =0 .0 392 5+ 0 .0 0 12 3n的斜率知 0 .0 0 39>0 .0 0 12 3,说明细菌对西药能比较容易地产生耐药性且产生的较快 ,而对中药产生的较慢 ,这从一个侧面显示出传统中草药独特的功效和极强的生命力 .(2 )　本文不仅给出了耐药性的规律 ,而且也给出了头孢曲松钠的最小抑菌浓度 ,钩藤碱的最佳促菌浓度和最小抑菌浓度 ,该参数可为筛选药物 ,确定最佳用药量提供定量依据 .(3)　由表 2可知 ,用头孢曲松钠培养的耐药菌对钩藤不产生耐药性 ,同样用钩藤碱培养的耐药菌对头孢曲松钠也不产生耐药性 ,本研究可为临床用药提供理论参考 ,治疗过程中可以轮换用药 ,以提高治疗效果微量量热法研究细菌对头孢曲松钠和钩藤碱的耐药性@程远征$曲阜师范大学化学科学学院!273165,山东省曲阜市 @李金花$曲阜师范大学化学科学学院!273165,山东省曲阜市 @张洪林$曲阜师范大学化学科学学院!273165,山东省曲阜市微量量热;;耐药性;;钩藤;;头孢曲松钠;;大肠杆菌用瑞典ThermalMetricAB公司制造的新型微量量热仪(3114 /32 36TAMAir)测定了不同浓度的头孢曲松钠、钩藤碱对大肠杆菌代谢作用的热功率—时间曲线,计算出细菌代谢的生长速率常数,建立了生长速率常数与药物浓度的关系,进而确定了最小抑菌浓度,在亚抑菌浓度下培养耐药菌,测出在亚抑菌浓度作用下的每一代耐药菌生长代谢的热功率—时间曲线,计算出每一代耐药菌的生长速率常数,建立了生长速率常数与传代次数之间的关系,进而得出了细菌对中西药耐药性的规律[1]雷连成.细菌的耐药性[J].中国兽药杂志,2002,36(11):41～44. [2]孙文基.天然药物成分提取分离与制备[M].北京:中国医药科技出版社,超星图书馆,1999. [3]聂毅,刘晓静,张洪林,等.微量量热法研究草乌生物碱对细菌的代谢作用[J].曲阜师范大学学报(自然版),2003,29(1):82～84.