细胞内高钙对小鼠小脑浦肯野细胞动作电位编码的影响

作者:黄丽;赵士弟;葛敏;王晋辉 刊名:蚌埠医学院学报 上传者:李玉明

【摘要】目的:通过向细胞内微量注射IP3受体激动剂诱发细胞内高钙,探讨细胞内高钙对小鼠小脑浦肯野细胞内在电生理特性变化的影响。方法:取小鼠小脑蚓部做矢状切片(400μm)。采用Axoclamp-2B放大器全细胞记录模式,记录细胞内Ca2+浓度升高前后浦肯野细胞动作电位的阈电位和绝对不应期;电信号输入pClamp9.2软件获取和分析群集发放的动作电位峰间距和动作电位峰时程标准差,进行数据采集和分析,观察细胞内Ca2+浓度升高早期浦肯野细胞内在电生理特性的变化。结果:细胞内Ca2+浓度升高后的短时间内,与高钙前相比,小脑浦肯野细胞群集发放动作电位的不应期缩短和激发动作电位的阈电位降低(P<0.001)。结论:细胞内高钙改变动作电位的不应期和阈电位,使浦肯野细胞兴奋增加,动作电位的编码能力降低。

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小脑的功能主要是维持人体的平衡及协调骨骼肌的运动,并在认知过程的短期记忆及其他一些复杂的神经生理活动中起重要作用。缺血性脑损伤诱导浦肯野细胞兴奋性增高的因素包括谷氨酸释放增加、细胞内钙超载和自由基增多等,这可能是缺血后患者出现共济失调的病理生理基础[1]。钙成像显示,脑缺血后的早期细胞内Ca2+浓度升高[2]。本研究通过记录电极向细胞内微量注射IP3受体激动剂(Adenophostin-A,1mol/L)诱发细胞内高钙,探讨升高细胞内Ca2+浓度后小脑浦肯野细胞内在兴奋性的变化及其可能机制,以期研究细胞内高钙与浦肯野细胞缺血性损伤的相关性,为临床预防缺血性小脑损伤提供实验基础和理论依据。1材料与方法1.1溶液配制人工脑脊液(切脑液)组成(mmol/L):124NaCl,3KCl,1.3NaH2PO4,26NaHCO3,10dextrose,5HEPES,0.5CaCl2和4MgSO4,pH7.35~7.45(1mol/LNaOH调节pH)。人工脑脊液(灌流液)组成(mmol/L):124NaCl,3KCl,1.3NaH2PO4,26NaHCO3,10dextrose,5HEPES,2.4CaCl2和1.3MgSO4,pH7.35~7.45(1mol/LNaOH调节pH)。标准电极液组成(mmol/L):150K-gluconate,5NaCl,5HEPES,0.4EGTA,4Mg-ATP和0.5Tris-GTP,pH7.35~7.45(2mol/LKOH调节pH)。包含IP3受体激动剂的电极溶液是将Adenophostin-A加入标准电极液中,其最终浓度为1mol/L[2]。1.2试剂与设备Tris-GTP、EGTA、Mg2+-ATP、5HEPES(Sigma公司)。IR-DIC光学显微镜(NikonE600FN,日本),Axoclamp-2B放大器(美国Axon公司)、微电极管拉制仪(P-97,美国SUUTTER公司)、振荡切片机(美国VIBRATOME公司)。1.3实验方法1.3.1脑片制备取出生后15~21天FVB-Tg(GadGFP)4570Swn/J小鼠小脑,将其蚓部放入充分氧合的冰水混合人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)中。将小脑蚓部切成400m脑片,放入充分氧合的ACSF,在25下孵育1~2h[3]。1.3.2浦肯野细胞选择将培养好的1片脑片转运到充分氧合的ACSF浸没的浴槽内,温度为31,灌流速度为2ml/min,进行全细胞记录[3]。在IR-DIC光学显微镜下选择浦肯野细胞。1.3.3细胞内高钙模型的制备通过记录电极向记录的神经细胞内微量注射Adenophostin-A(1mol/L)。采用在电极尖端先灌注标准电极溶液之后,再将含有Adenophostin-A的电极溶液灌到电极后端,这可以使其扩散到记录的神经元中。这项技术已经用荧光素和生物素得到了证实[4]。先测量群集发放的动作电位内在特性作为细胞内高钙前;5min后再次测量群集发放的动作电位内在特性,为细胞内高钙后。1.3.4全细胞记录采用Axoclamp-2B放大器电流钳全细胞记录模式,将采集的电信号输入pClamp9.2分析软件以获取和分析资料。放大器高频滤波为3kHz。利用去极化电流脉冲诱发动作电位。1.4细胞阈电位(Vr)、绝对不应期(ARP)、群集发放的动作电位峰间距(inter-spikeinterval,ISI)和动作电位峰时程标准差(standarddeviationofspiketiming,SDST)测定小脑浦

参考文献

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