大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

作者:林卡娜;方三华;蔡蓓蕾;王欣欣;卢韵碧;张纬萍;魏尔清 刊名:浙江大学学报(医学版) 上传者:曹磊

【摘要】目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究。方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD4处理后细胞内钙变化。结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD4可诱导细胞内钙的增加。结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础。

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收稿日期: 200909203 修回日期: 200909229 基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30772561); 浙江省科技计划重点资助项目(2005C23041). 作者简介: 林卡娜(1986- ) , 女, 硕士研究生 . 通讯作者: 魏尔清(1952- ) , 男, 博士, 教授, 博导 . 从事神经药理学研究; E2mail:w eieq2006@zju. edu. cn http: ∥www. journals. zju. edu. cngmed DO I: 10. 3785gj. issn. 100829292. 2009. 06. 006 大鼠GPR17 基因真核表达载体的构建及其功能鉴定 林卡娜, 方三华, 蔡蓓蕾, 王欣欣, 卢韵碧, 张纬萍, 魏尔清 (浙江大学医学院药理学系, 浙江 杭州, 310058) [摘 要] 目的: 构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA 3. 1(+ )rGPR17, 并对其 功能进行初步研究。方法: 从大鼠脑组织提取总RNA , 通过RT2PCR 扩增 rGPR17 cDNA , 与载体 pcDNA 3. 1(+ )连接, 并转化到大肠杆菌DH5Α以获得重组载体pcDNA 3. 1(+ )rGPR17, 以PCR、 双酶切和测序鉴定; 将重组载体pcDNA 3. 1 (+ )rGPR17 通过脂质体转染方法, 转染HEK293 细 胞, RTPCR、免疫荧光法检测 rGPR17 的表达, Fluo4 测定激动剂L TD 4处理后细胞内钙变化。结 果: RT2PCR、双酶切和测序证明, 重组的真核表达载体pcDNA 3. 1 (+ )2rGPR17 构建成功, 并在 HEK293 细胞获得表达, 加入外源性激动剂L TD 4可诱导细胞内钙的增加。结论: 成功构建了rGPR17 的真核表达载体pcDNA 3. 1(+ )2rGPR17, 并在HEK293 细胞功能性表达, 为GPR17 受体 及其拮抗剂的研究提供了基础。 [关键词] 半胱氨酸g遗传; 受体, 白三烯g遗传; 遗传载体; GPR17; 真核表达载体; HEK293 细 胞; 细胞内钙 [中图分类号] Q 256;Q 421  [文献标志码] A   [文章编号] 100829292(2009) 060584207 Construction and identif ication of eukaryotic expression vector of rat GPR17 gene L IN Kana, FAN G San2hua, CA I Bei2lei,WAN G Xin2xin, LU Yun2bi, ZHAN G W ei2p ing,W E I Er2qing (D ep artm ent of P harm acology , College of M ed icine, Zhejiang U niversity , H angzhou 310058, China) [Abstract] Objective: To construct the eukaryotic exp ression vector of rat GPR17 (rGPR17) cDNA , and to identify its function in HEK293 cells. M ethods: Total RNA w as extracted from rat brain tissue; full2length GP

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