FHL2参与调控MCF-7细胞周期

作者:杨尧;陈湘;刘萱;李平;马清钧;曹诚 刊名:生物技术通讯 上传者:郭明喜

【摘要】目的:研究FHL2对细胞周期阻滞的影响。方法:应用pSR-GFP/Neo载体构建FHL2-siRNA干扰载体,转染MCF-7细胞,G418筛选稳定细胞系,通过流式细胞仪检测离子辐射后细胞周期的变化。结果:利用设计的FHL2-siRNA干扰载体能够干扰细胞中FHL2的表达;当离子辐射后,FHL2敲除细胞G2/M期阻滞的程度比野生型细胞显著降低。结论:FHL2参与调控MCF-7细胞离子辐射后细胞周期G2/M期阻滞。

全文阅读

FHL2是FHL(fourandahalfLIMdomain)家族成员之一,它由4个半LIM结构域组成[1],半个LIM位于N端,每个LIM结构域由富含半胱氨酸的50多个氨基酸组成的双锌指模序构成。FHL2在细胞质和细胞核中都有分布,与多种蛋白相互作用[2],主要作为辅助转录因子与多种转录因子结合调控基因转录,参与多条信号通路的信号转导,如与雄激素受体(AR)作用,促进AR靶基因转录[3];与-catenin(联蛋白)结合促进Wnt/-catenin信号通路活性[4];能将Rho信号从细胞膜传递到细胞核[5]。近年来的研究发现,FHL2与肿瘤密切相关,如FHL2在横纹肌肉瘤中表达水平下降[1],而在前列腺癌[6]、肺癌中高表达[7],另有研究表明FHL2与结肠癌、胃癌的致瘤性相关[8]。FHL2主要在心脏中表达,在脑、肝、肺和肌肉等其他器官中也有分布,在脾、胸腺、血粒细胞、皮肤中不表达[9]。FHL2最初被发现是作为转录因子p53调控的一个下游因子,p53能激活FHL2的转录,离子辐射诱导的DNA损伤后激活p53从而激活FHL2的转录[10],在人的外周血淋巴细胞中,离子辐射以剂量依赖的方式提高FHL2的转录水平,可达9倍[11],但FHL2在离子辐射应激中发挥的功能没有得到研究。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种将双链RNA(dsRNA)导入细胞,使得同源mRNA特异性降解的现象。由此发展起来的RNAi技术以特异性强、方便和快捷的优点,广泛应用于基因组功能研究、靶位点测定及基因敲除等技术领域[12]。我们采用RNAi技术构建pSR-GFP/Neo-FHL2-siRNA质粒载体,特异性沉默MCF-7细胞内FHL2的表达,获得了FHL2敲除细胞系,为研究FHL2在离子辐射应激中的功能提供了实验基础。1材料与方法1.1材料293T、MCF-7细胞,质粒载体pSR-GFP/Neo为本实验室保存;限制性内切酶和T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;大肠杆菌DH5感受态细胞购自博大泰克公司;FHL2和Tubulin(微管蛋白)鼠单克隆抗体购自SantaCruz公司;HRP标记的羊抗鼠IgG购自中杉公司;质粒提取试剂盒为Promega公司产品;转染试剂LipofectAMINE2000、RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司。1.2FHL2-siRNA的设计与合成按照小干扰RNA(siRNA)序列设计原则,根据GenBank数据库中fhl2的基因序列(基因编号BC093049),筛选3段特异性靶序列,用Blast证实它们与其他基因和EST无同源性,设计合成如下2条带有Bgl和Hind粘性末端的FHL2-siRNA靶序列:5'GATCCCCTACATCTCCTTTGAGGAACTTCAAGAGAGTTCCTCAAAGGAGATGTATTTTTA3',5'AGCTTAAAAATACATCTCCTTTGAGGAACTCTCTTGAAGTTCCTCAAAGGAGATGTAGGG3'。1.3pSR-GFP/Neo-FHL2-siRNA载体的构建将合成的fhl2siRNA单链DNA片段上下游序列各取1L,加入48L退火缓冲溶液(100mmol/LNaCl,50mmol/LHEPES,pH7.4),90温育4min,自然冷却到70,放置10min,自然冷却到10,-20保存。将pSR-GFP/Neo用Hind、Bgl酶切且回收后与退火产物连接,16水浴过夜,连接产物转化DH5感受态细胞,用含氨苄青霉素(Amp)的LB平板筛选,挑克

参考文献

引证文献

问答

我要提问