小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定

作者:余昆;苟欣;杨华安;周青松;夏阳 刊名:生物技术 上传者:梁国荣

【摘要】目的:应用质粒pEGFP-N1构建含小鼠survivin基因的重组真核载体。方法:采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,自行设计一对分别含有HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的survivin基因上下游引物,利用PCR扩增出该基因的全序列cDNA,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1/survivin重组真核表达载体。然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果:双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组真核表达载体。结论:重组真核表达载体pEGFP-N1/survivin构建成功,为下一步研究sur-vivin在未成熟树突状细胞中诱导分化与致耐受作用奠定基础。

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Survivin基因是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitorofap-optosisprotein,IAPs)家族新成员,具有强大的抗凋亡以及调节细胞增殖功能[1,2];且能编码产生一个由142个氨基酸组成的相对分子量为16.5kD的蛋白[3],该蛋白高表达于胚胎组织及各种恶性肿瘤组织,而在正常已分化的成熟组织中低表达甚或不表达[4],表现出随着细胞的增殖分化,survivin表达总体呈现出下降趋势。树突状细胞(dendriticcell,DC)是目前发现的功能最强和最有效激活静息T细胞的专职抗原递呈细胞(antigenpresentingcell,APC),大量研究报道认为处于未成熟状态的DC(immaturedendriticcell,iDC)在诱导机体免疫耐受中具有至关重要的作用[5,6]。然而,有关survivin与DC致耐受方面的关系国内外尚无相关报道,因此,为研究survivin在iDC中诱导分化与致耐受作用,作者课题组构建了重组真核表达载体pEGFP-N1/sur-vivin。1材料和方法1.1材料1.1.1菌种和质粒大肠杆菌DH5由重庆医科大学病原微生物学教研室保存,质粒载体pEGFP-N1为美国Clontech公司产品。1.1.2试剂T4DNA连接酶购自美国Invitrogen公司,限制性内切酶Hind、BamH及DNAmarker均为日本TaKaRa公司产品;质粒提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自美国Promega公司;PCR引物合成与测序由上海英俊生物技术有限公司完成。1.1.3仪器低温高速离心机(Heraeus公司)、凝胶成像仪(Bio-Rad公司)、Millipore纯水器(Millipore公司)、DU800核酸蛋白分析仪(Backman公司)。1.2方法1.2.1目的基因survivin的PCR扩增反应参照已在GenBank上报道的小鼠survivin序列(NM-009689)设计一对引物,根据双酶切所需,在每条引物的5端引入相应的限制酶切位点及保护性碱基,采用Oligo核酸分析软件进行分析,引物序列如下:F(survivin基因上游引物,5端含有Hind酶切位点):5’-CCCAAGCTTATGGGAGCTCCG-GCGCTG-3’,R(survivin基因下游引物,5端含有BamH酶切位点):5’-CGCGGATCCCGGGCAGCCAGCTGCTCAATTGA-3’,下划线标记为酶切位点。PCR反应体系如下:ddH2O37.7l、10Buffer5l、MgSO41l、dNTP(10mmol/L)1l、F1l、R1l、模板质粒1l、DMSO2l、Taq酶0.3l。反应条件:94,变性2min;9420s6、020s、6840s,共25个循环;68再延伸5min,取2lPCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.2目的基因survivin和载体pEGFP-N1的双酶切1.2.2.1双酶切目的基因survivin回收上述PCR产物(具体操作按说明书),以Hind、BamH双酶切,获得438bp的survivin基因片段。将已纯化PCR产物(50ng/l)20l6、Hind1l、BamH1l、10KBuffer5l混合加ddH2O23l定容至50l,37酶切1h。纯化和胶回收后取2l胶回收产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.2.2双酶切载体pEGFP-N1将pEGFP-N1(200ng/l)10l、Hind1l、BamH1l、10KBuffer5l混合加ddH2O33l定容至50l

参考文献

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