Leptin对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达的调控

作者:朱金改;赵亚萍;张春梅;陈小慧;高春林;朱春;郭锡熔 刊名:南京医科大学学报(自然科学版) 上传者:王保卫

【摘要】目的:观察leptin对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达的调节作用。方法:体外培养人前体脂肪细胞,在诱导人前体脂肪细胞分化成熟的基础上,应用100ng/ml人重组leptin分别干预成熟脂肪细胞6、24h,采用实时荧光定量RT-PCR技术检测成熟脂肪细胞中NYGGF4基因mRNA的表达水平。结果:100ng/ml leptin干预人成熟脂肪细胞6h后,NYGGF4基因mRNA的相对表达量为0.000476±0.000178,显著低于对照组0.00114±0.000275,P<0.05;干预24h NYGGF4基因mRNA的相对表达量为0.000835±0.000211,也显著低于对照组0.001419±0.000193,P<0.05。结论:leptin能显著下调成熟脂肪细胞中NYGGF4基因的表达。

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近年来,肥胖儿童检出率不断增高、2型糖尿病呈现明显低龄化趋势的现象已引起各国儿科学者的广泛关注[1-2]。由于肥胖儿童中普遍存在胰岛素抵抗指数升高,与其成人期代谢性疾病的发生关系密切,因此探讨肥胖致胰岛素敏感性降低或胰岛素抵抗的机制已成为儿科研究领域的一个重要内容[2]。近来研究发现脂肪组织不仅是机体能量贮存的重要场所,还是一个重要的内分泌器官,在肥胖病理状态下可分泌过多脂源性细胞因子如leptin、adiponectin、resistin等,影响机体的胰岛素敏感性[3],因此针对脂肪组织开展肥胖遗传学研究,并从正常与肥胖者脂肪组织中寻找差异表达基因可为肥胖致胰岛素抵抗的机制提供全新的研究线索。前期研究中,本研究小组以抑制性差减杂交(suppressivesubtractivehybridization,SSH)技术筛选肥胖与正常人网膜脂肪组织中的差异表达基因,发现一条在肥胖者脂肪组织中表达显著上调的新基因NYGGF4(GeneBankID:AY317418)。进一步研究发现,NYGGF4基因在肥胖儿童脂肪组织中的表达亦明显高于正常儿童[4],且其基因过表达(overex-pression)能显著促进脂肪细胞的增殖[5],并通过抑制PI3K/AKT信号通路、减少GLUT4向胞膜转位的机制引发成熟脂肪细胞胰岛素刺激下葡萄糖摄取率的降低[6],提示NYGGF4是一条与胰岛素敏感性调节相关的差异表达基因。为深入探讨该差异表达基因的生物学特征及表达与调节规律,本研究以人前体脂肪细胞为研究工具,应用重组leptin干预分化成熟的脂肪细胞,采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了NYGGF4基因的表达水平,分析了leptin对脂肪细胞中NYGGF4基因表达的调节作用,现结果报告如下。1材料与方法1.1材料人前体脂肪细胞株(humanpreadipocytes-vis-ceral,HPA-v)购自美国Sciencell公司,DMEM培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司,胰岛素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黃嘌呤(MIX)、罗格列酮、人重组leptin购自美国Sigma公司,油红O染料购自上海化学试剂厂,pMD18-T载体、逆转录试剂购自美国Promega公司,质粒DNA提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司,实时荧光定量PCR中MasterMix购自美国ABI公司,PCR引物及探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成、标记。1.2方法1.2.1人前体脂肪细胞培养与诱导分化用完全培养液(DMEM+10%胎牛血清+青、链霉素100U/ml)在37孵箱(5%CO2、95%空气)中培养人前体脂肪细胞,每2天换液1次。细胞生长至完全融合时开始诱导分化,培养液换用含0.5mmol/LMIX、1mol/L地塞米松和5g/ml胰岛素的无血清DMEM培养液。48h后,换液并加用1mol/L罗格列酮;于第4天起撤去MIX、地塞米松、罗格列酮,使培养液中只含有5g/ml胰岛素。每2天换液1次,至第17天约90%以上细胞已分化为成熟的脂肪细胞,应用油红O染色法验证。1.2.2脂肪细胞形态学观察油红O是一个常用的脂质染料,细胞固定后,经油红O染色,可在普通光镜下观察细胞内脂滴大小情况。1.2.3重组leptin干预在人前体脂肪细胞诱导分化的第18天,将细胞培养液换成含重组leptin100ng/ml的培养液,分别培养6和24h后收集细胞,以观察重组leptin干预不同时间对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达的影响。实验均设立对照组,各实验组设6个平行孔,收集细胞-70冻存备用。1.

参考文献

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