清热化瘀颗粒对脑缺血预处理大鼠XBP-1表达的影响

作者:苏锦勋;胡跃强;唐农;祝美珍;覃琴;张青萍 刊名:时珍国医国药 上传者:熊苑红

【摘要】目的观察清热化瘀颗粒对脑缺血预处理大鼠缺血再灌注后XBP-1 mRNA及其蛋白表达的影响。方法 SD大鼠80只,随机分为假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)、清热化瘀颗粒组(QRHY),每组按照再缺血后12h、1d、2d、3d 4个时间点分为4个亚组。采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用实时荧光定量PCR和Western blot法观察再缺血后各个时间点XBP-1 mRNA及其蛋白的表达变化。结果 MCAO组XBP-1 mRNA及其蛋白表达均于缺血再灌注后12 h开始明显上升,24 h达高峰(P<0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降,但仍保持较高表达水平(P<0.01);BIP组较MCAO组XBP-1 mRNA及其蛋白表达明显升高(P<0.05或P<0.01),QRHY组较BIP组进一步升高其表达(P<0.05)。结论脑缺血预处理可能通过诱导XBP-1表达发挥其神经保护作用,清热化瘀颗粒可促进其作用。

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脑缺血预处理(brainischemicpreconditioning,BIP)又称为脑缺血耐受(ischemictolerance,IT),是近年发现的重要内源性神经保护机制。最近有研究发现内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)在此环节中发挥了关键作用。其中X盒结合蛋白1(X-boxbindingprotein1,XBP-1)作为评价ERS的指标是内质网应激细胞保护信号途径中的关键分子[1],在抗凋亡途径中起重要的保护作用[2]。寻找增进IT的措施对缺血性脑卒中的预防和治疗有益,药物预处理成为近年来国内外研究的热点。清热化瘀方药理作用机制提示其可能促使预处理后延迟性脑缺血耐受的产生[3],但其机制有待于阐明。本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血预处理模型,以观察清热化淤颗粒联合BIP对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,从而为其临床治疗缺血性脑血管病提供理论依据。1材料与方法1.1动物分组及处理健康雄性SD大鼠80只,体质量(25050)g,随机将大鼠分为四组:假手术组(SO);大脑中动脉缺血组(MCAO):假手术+脑缺血组(SO+MCAO);BIP组:预缺血+脑缺血组(BIP+MCAO);清热化瘀颗粒组(QRHY):预缺血+清热化瘀颗粒+脑缺血。每组按照再灌注后12h、1d、2d、3d四个时间点平均分为4个亚组(n=5)。分别作如下处理:SO组:以假手术代替预缺血及缺血再灌注;MCAO组:以假手术代替预缺血,其余步骤同BIP组;BIP组:MCAO10min后抽出栓线,完成预缺血,3d后再次行MCAO2h,再灌注后12h、1d、2d、3d处死大鼠;QRHY组:缺血预处理10min后,在大鼠麻醉清醒后1h灌胃清热化瘀颗粒溶液,连续3d,每天上、下午各1次。3d后给予2hMCAO,再灌注后12h、1d、2d、3d处死大鼠。1.2动物模型的制备参照Longa的线栓法进行造模。采用大脑中动脉二次线栓法[4]制备大鼠脑缺血预处理模型,结扎大鼠左颈外动脉远端和颈总动脉近端,将前端用火焰烧圆的尼龙线从颈总动脉残端插入,进线约1820mm,MCAO后10min抽出线栓,完成预缺血。3d后再次行MCAO2h,规定时间点处死动物取脑。1.3药物制备清热化瘀方(水牛角、丹参、赤芍、地龙、石菖蒲等10味中药组成)单味中药浓缩颗粒剂,由江苏省江阴市江阴天江药业有限公司制备。灌胃液体量为每次1.4ml/100g大鼠,其浓度及等效剂量按体表面积折算。1.4主要试剂兔抗大鼠XBP-1多克隆抗体,美国SantaCruz公司产品;偶联有辣根过氧化物(HRP)羊抗兔IgG二抗,博士德公司产品;内参GAPDH,康成生物公司产品。总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司);PCR反应试剂盒及逆转录试剂盒(TaKaRa公司);引物及内参均由大连宝生物有限公司提供。1.5缺血半暗带脑皮质XBP-1mRNA表达测定大脑组织总RNA提取:参考Trizol试剂盒说明书提取总mRNA。引物合成:荧光定量RT-PCR所用的XBP-1和GAPDH引物序列如下:XBP-1,上游5-GGATGAATGCCCTGGTTACTGA-3;下游5-CAGAGGCGCACGTAGTCTGA-3,产物长度113bp;GAPDH,上游5-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3下游5-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3,产物长度133bp。比较两基因扩增效率:选取cDNA样品模板进行5倍梯度稀释,XBP-1与GAPDH分别进行real-timePCR反应,得出荧光曲线,通过cDNA

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