铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制差减杂交文库的构建及序列分析

作者:赵明明;张岗;宋超;张大为;郭顺星 刊名:中国药学杂志 上传者:王秋

【摘要】目的研究铁皮石斛(Dendrobium officinale)种子接菌共生萌发差异基因表达谱特征。方法采用抑制差减杂交(SSH)技术,分别以接菌及未接菌培养5周的铁皮石斛种子cDNA作为检测子与驱赶子,构建铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制性消减cDNA文库。结果对部分克隆产物测序,经GenBank中BLASTx同源比较后,进行基因功能注释,得到100个具有植物同源性的表达序列标签(EST),主要涉及细胞与染色体结构、RNA合成、信号转导、能量与代谢、蛋白质合成与降解及细胞防御等。随机挑选5个目标基因,实时荧光定量PCR分析发现这5个基因在共生萌发的种子中均上调表达。结论铁皮石斛种子接菌共生萌发涉及多种途径相关基因表达调控,本实验为兰科植物种子萌发分子机制研究奠定基础。

全文阅读

兰科(Orchidaceae)植物种子对生存环境的要求十分严格,种子细小如粉[1],成熟时为原胚阶段,无胚乳,萌发率低[2-3]。Bernard将蝴蝶兰属(Pha-laenopsis)分离到的真菌同蝴蝶兰种子共生培养,发现了真菌被植物胚细胞消化的现象[4]。现今大部分研究也证明兰科植物种子在自然条件下的萌发必须依赖与其共生真菌的存在[5]。兰科植物种子萌发的研究多集中于体外无菌萌发及幼苗发育上[6-7],关于其与真菌共生萌发的研究报道较少,主要是由于能够分离并纯培养的促萌发真菌较少且其促萌发作用又对植物种类有一定的专一性[8]。目前,国际上仅有部分兰科植物种子共生萌发及其促萌发真菌的报道,促萌发真菌多集中于胶膜菌属及蜡壳菌属[9-10]。铁皮石斛作为名贵中药材,具有滋阴清热,生津益胃,润肺止咳,明目强身等功效[11],临床上被广泛应用,但同样面临着种子在野生条件下萌发率低,自然资源匮乏[12]的危机。虽然有促萌发真菌分离等相关研究,但种子与真菌共生萌发的机制研究鲜有报道,且停留在真菌入侵兰花种子位点[13],入侵后种子结构变化[14]及营养物质交换等方面[15]。关于兰科植物种子与真菌分子互作机制仍不清楚,远远341中国药学杂志2013年3月第48卷第5期ChinPharmJ,2013March,Vol.48No.5落后于植物-丛枝菌根/根瘤菌的研究[16-17]。随着分子生物学技术的发展,从分子水平解析兰科植物种子萌发机制,将对兰科植物的系统性研究产生重大的指导意义。本实验以珍稀濒危药用植物铁皮石斛种子-真菌为研究体系,以共生萌发的种子为检测子(tester),未萌发的种子为驱赶子(driver),构建种子接菌共生萌发的抑制差减杂交(SSH)cDNA文库并进行序列分析,为阐明兰科植物种子共生萌发的分子机制及其与真菌分子互作机制奠定理论基础。1材料和方法1.1植物材料及培养铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)成熟蒴果,采摘自云南,西双版纳(2010年11月,4运输,保证蒴果在未播种前未开裂)。促铁皮石斛种子萌发真菌3601号为蜡壳菌属真菌Sebacinasp.[10]。播种分为2组,T样本(实验方)组:在OMA培养基[18]上接种3601号菌株,培养2周,待菌落长满平板后,无菌条件下,剖开蒴果,于是先放置于培养基中部的尼龙网(200目,2cm2cm)上播种铁皮石斛种子;D样本(驱动方)组:于T样本组播种的同一天,相同播种条件,将铁皮石斛种子直接播种于未接菌的OMA培养基上,光照强度15002000lx,光照时间12hd-1,培养5周后,两组样本同时取样,液氮速冻后置于-80冰箱备用。1.2总RNA提取及质量控制取相同条件下培养5d的T、D样本各100mg,用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取总RNA。总RNA经DNaseI消解去除基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测质量,核酸蛋白分析仪(Nano-Drop2000)进行浓度和纯度的检测。1.3SSH文库的构建按照PCR-SelectTMcDNAKit(clontech)手册,构建共生萌发的铁皮石斛种子抑制消减文库。以共生萌发的T样本组种子,形态学观察全部种子均达到种子萌发的第3级阶段[19],作为差减杂交的检测子;以D样本组,形态学观察全部种子均未萌发,处于萌发的第0级阶段,作为差减杂交的驱赶子。检测子及驱赶子的双链DNA合成按照SMARTerPCRcDNASynthesisKit(clontech)手册步骤进行。1.4阳性克隆筛选及测序SSH产物按QIAquickPCRP

参考文献

引证文献

问答

我要提问