人自体肿瘤细胞凋亡抗原负载的DC疫苗的临床应用研究

作者:陈群英;滕德义;段晓波;郑马庆 刊名:中国临床研究 上传者:陆璐

【摘要】目的探讨人自体肿瘤细胞凋亡抗原负载的树突状细胞(DC)疫苗的实验室制备、临床应用安全性及初步疗效。方法 1例卵巢腺瘤Ⅱ~Ⅲ级,(种植灶)低分化腺癌患者,右卵巢癌术后22个月,发现腹腔转移半个月。患者签署知情同意书后,造血动员,无菌100ml抗凝全血,制备DC疫苗。收获DC疫苗前对培养上清进行细菌内毒素、细菌、真菌及支原体检测。检查合格后分4次腹股沟淋巴结富集区皮内注射。在回输前1天及每次回输后第3天抽血,进行血常规、肝功能、白介素(IL)系列及自然杀伤(NK)细胞项目检查。结果制备的DC疫苗质量检查合格,回输后患者无任何不适反应。血常规及肝功能值均在正常范围内,无明显变化,IL-2、IL-4和IL-12有明显提高,NK细胞回输后也提高至约2.45~3.40倍。结论自体肿瘤细胞凋亡抗原负载的DC疫苗回输是安全的,且显示出一定的疗效。

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树突状细胞(dendriticcells,DC)是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞(APC),因细胞伸展如树枝状,故名,是启动、调控和维持免疫应答的中心环节[1]。目前,活化的DC已经成为某些肿瘤的有效治疗手段之一,也成为其他多种疾病包括感染性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥等治疗的希望所在[2-3]。以肿瘤细胞为基础的DC疫苗主要有:肿瘤抗原肽负载DC、肿瘤核酸负载DC、肿瘤细胞株负载DC、自体肿瘤细胞凋亡抗原负载DC等。这些DC疫苗为肿瘤的免疫治疗增添了新内容,并在部分恶性肿瘤的治疗中取得了令人振奋的效果,显示出DC疫苗在恶性肿瘤等疾病治疗中的巨大前景[4]。本文探讨自体肿瘤细胞负载的DC疫苗实验室制备后回输给患者的安全性及初步疗效。1资料与方法1.1病例资料患者,女性,42岁,右卵巢腺癌级,种植灶低分化腺癌。右卵巢癌术后22个月,发现腹腔转移半个月。事先与患者及家属沟通并签署知情同意书。1.2方法DC疫苗的制备:应用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)进行造血动员,4d后静脉抽血100ml。抽血时注意事先加入抗凝剂及无菌操作。将采集的血液标本离心,血清灭活后离心保存备用,细胞用生理盐水倍稀释。轻轻吹打混匀后缓慢顺管壁加入B淋巴细胞分离液(密度1.077)上。细胞与淋巴细胞分离液体积比为212500rpm离心30min,吸取白膜层,离心洗涤3次。铺板。贴壁2h后,洗涤,充分移走悬浮细胞。加入诱导培养液I[含1640、10%自体血清、GM-CSF及白细胞介素(IL-)4]。第3天1/3换液。第5天收获未成熟细胞,计数次分4份备用,其中1份加入凋亡抗原负载,另外3份液氮冻存备用。加入凋亡抗原后第2天加入诱导培养液[含诱导成熟肿瘤坏死因子(TNF-)]诱导成熟。第3天收获成熟DC。凋亡抗原制备将保存的患者自身癌肿瘤组织剔除坏死组织、脂肪及结缔组织。按照原代细胞培养方法制备肿瘤细胞。加入凋亡药物5氟尿嘧啶及紫杉醇,凋亡过夜。离心收集凋亡抗原。DC疫苗的质量检测:第6天取DC培养上清进行细菌、真菌及支原体检测,第7天收获时进行细菌内毒素检测。检测标本送交医院检验科,按照标准流程检验。收获DC时同时计数细胞数,在细菌内毒素及支原体检测结果均为阴性、细菌、真菌培养无菌生长时方可回输給患者。回输:注射方式为在患者腹股沟淋巴结富集区10cm范围内皮内注射。为减轻患者疼痛,采用18G浅静脉贝朗留置针(配BD血气针筒)。注射后留观1h。回输共分4次,每周进行1次。分别在第1次回输前1天及回输后第3天抽血进行血常规、肝肾功能及免疫因子、自然杀伤(NK)细胞检查。2结果2.1成熟及未成熟DC的形态差别来源于CD14+前体DC最初显示很强的贴壁性能。在用诱导培养液诱导成未成熟DC时,DC逐渐悬浮,并形成各种突起,而在用凋亡抗原诱导成熟后,成熟的DC似乎又逐渐变圆,并似乎又有贴壁趋势。结果见图1。2.2回输前后血常规及肝功能监测注射DC疫苗后对患者血常规及肝肾功能没有明显影响,均在正常范围内。2.3DC疫苗回输前后IL及NK细胞的变化回输后IL-2、IL-4及IL-12均明显升高。而NK细胞在第2次回输和第4次回输后比回输前分别提高至约2.45倍和3.40倍。见表1。图1成熟及未成熟DC的形态差别(1aDC培养第3天图片;1bDC培养第7天图片)表1患者回输DC前后IL系列及NK细胞的变化(%)时间IL-2(ng/ml)IL-4(ng/ml)IL-12(ng/ml)NK(%)回输前1016653.98第1次回输后第3天3621629.

参考文献

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