耐铝大豆BX10铝胁迫下基因表达差异初步分析

作者:黄守程;钱立生;叶梅荣;刘爱荣 刊名:热带作物学报 上传者:刘成立

【摘要】以耐铝大豆种质BX10为材料,以0或50μmol/L铝处理48 h的根尖RNA为样品,反转录成cDNA第一链后,利用cDNA-RAPD技术研究铝处理下大豆基因表达差异的情况。结果表明:从72条随机引物中筛选出9条能产生稳定差异的引物,多态性比率为12.5%;9条随机引物共扩增得到19个差异表达的基因,其中,50μmol/L铝处理组中6个基因表达下调,2个基因不表达,10个基因表达上调,1个基因受铝诱导特异性表达。此结果可为进一步挖掘大豆抗铝基因提供候选靶标及耐铝机理的研究奠定一定的理论基础。

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铝毒害是影响作物产量与品质的重要限制因子[1]。全世界约有40%以上的耕地属于酸性土壤[2],中国南方也有14个省(自治区、直辖市)是酸性土壤,面积达到218万km2,占全国土地面积的22.7%[3]。已有研究表明,植物抗铝是多基因参与的复杂网络,分离铝胁迫差异表达基因是阐明抗铝分子机制的关键途径。目前,分离差异基因有多种方法,主要包括mRNA差异显示技术(DD)[4]、代表性差异分析(RDA)[5]、基因表达系列分析(SAGE)[6]、抑制消减杂交法(SSH)[7]、cDNA-RFLP[8]、cDNA-RAPD[9]、cDNA芯片[10]及基于高通量测序的转录组测序技术等[11]。cDNA-RAPD技术分离差异表达基因是一种经济省时的方法,孙树业等[9]运用cDNA-RAPD研究了籼稻光敏核不育基因的差异表达特征,Jagadeesh等[12]利用cDNA-RAPD技术发现了棉花(GossypiumhirsutumL.cvKC3)1个新的抗旱基因。大豆[Glycinemax(L.)Merr]是对铝毒害最为敏感的作物之一,目前尚未有采用cDNA-RAPD技术分离大豆铝胁迫下表达差异基因。为挖掘大豆潜在的抗铝基因的报道,本研究以耐铝大豆种质BX10为材料,以0或50mol/L铝处理48h后的根尖RNA为样品,结合cDNA-RAPD技术对其进行差异表达基因分析,为解析大豆耐铝机制提供新的实验依据,并为大豆耐铝遗传改良提供合适的基因靶标。编号引物名称引物序列扩增产物/bp1S15GGAGGGTGTT450,6202S19ACCCCCGAAG380,7003S28GTGACGTAGG5004S36AGCCAGCGAA500,6005S53GGGGTGACGA400,500,9006S65GATGACCGCC500,14007S67GTCCCGACGA530,800,10008S68TGGACCGGTG600,15009S69CTCACCGTCC1200,1300表1差异引物及扩增产物1材料与方法1.1材料大豆BX10的培养与处理:大豆[Glycinemax(L.)Merr]材料的培养参照Zhen等[13]的方法,培养4d后选取生长良好且一致的幼苗,分成对照组0mol/LAl3+(含100mol/LCaCl2,pH4.6)和处理组50mol/LAl3+(含100mol/LCaCl2,pH4.6)分别处理48h,然后用Trizol法提取大豆根尖RNA。1.2方法1.2.1RT-PCR利用Promega公司的反转录试剂盒合成cDNA第一链,以此cDNA为模板做RAPD分析。10-碱基随机引物(见表1)由上海生工生物工程有限公司合成。20LPCR反应体系如下:20ngcDNA,0.5mol/Lrandomprimer,0.2mmol/LdNTPs,1PCRreactionbuffer(Mg2+plus)以及0.5UTaq聚合酶(TIANGEN)。PCR反应程序为:预变性945min;941min,361min,722min,反应40个循环;最后72延伸5min。1.2.2电泳检测扩增产物在1.5%琼脂糖中100V稳压电泳1h,EB染色,紫外灯下观察拍照并分析。2结果与分析2.1随机引物的筛选对72条随机引物进行差异筛选,3次重复后仍表现出相同带型的随机引物作为目的引物。最终确定9条引物能够在处理组(50mol/LAl3+)和对照组(0mol/LAl3+)扩增出差异产物,结果见表1。2.29条随机引物对0和50mol/LAl3+处理下大豆BX10表达差异基因筛选由图

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