尼可地尔对内皮细胞氧化应激损伤的保护作用

作者:雷斌;邹东华;何世安;黄振坚;严翼飞;卢华文;陈昊 刊名:中国临床药理学杂志 上传者:张俊

【摘要】目的研究尼可地尔对体外内皮细胞氧化应激引起的损伤的保护作用。方法在体外培养基中,加入终浓度为100μmol.L-1的过氧化氢,给予人脐静脉内皮细胞氧化应激暴露24 h。用MTT法检测细胞增殖,Hoechst33258染色观察细胞核形态学,流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光定量分析一氧化氮生成。结果氧化应激引起内皮细胞增殖抑制及细胞核形态异常,使细胞凋亡率从(11.9±3.4)%上升至(78.6±7.6)%。尼可地尔可明显减轻氧化应激引起的细胞增殖抑制及细胞核形态改变,并使细胞凋亡率降低至(48.8±5.1)%;同时尼可地尔可减轻氧化应激引起的内皮细胞一氧化氮生成障碍。尼可地尔的保护效应可被线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-hydroxydecanoate部分逆转。结论尼可地尔可减轻氧化应激引起的内皮细胞凋亡及功能损害,该保护作用与开放线粒体ATP敏感性钾通道有关。

全文阅读

血管内皮的缺血再灌注损害常见于各种血管介入手术中,如经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)及动脉搭桥术等。尼可地尔在心脏缺血再灌注损伤过程中对心肌细胞具有显著的保护作用[1-3]。在其他组织器官也有类似的保护作用[4]。临床上尼可地尔作为一种血管舒张剂应用于心绞痛的预防与长期治疗。然而尼可地尔是否对血管内皮具有同样的效应尚未见报道。本实验研究尼可地尔对体外培养血管内皮细胞氧化应激损伤的保护作用。材料与方法1材料药品与试剂尼可地尔,规格:每支50mg,批号:MFCD00186520,购自美国Sigma公司。MTT、缓激肽、H2O2水溶液及5-HD(5-hydroxydecanoate),均Sig-ma公司生产;胎牛血清、Media199培养基、平衡盐溶液及胰蛋白酶,均美国Gbico公司生产;Hoechst33258染色剂、AnnexinV-FITC结合液及碘化丙啶染色液(PI),均购于上海碧云天公司。仪器Forma3110细胞培养箱,美国Thermo公司产品;UV-2500分光光度计,日本岛津公司产品;TE300荧光显微镜,日本尼康公司产品;FACS-Aria流式细胞仪,美国BDBioscience公司产品。细胞人脐静脉内皮细胞系(HUVECs),上海博晗生物科技有限公司提供。2实验方法MTT细胞增殖实验分4组:空白组,模型组(氧化应激),实验组(氧化应激+尼可地尔组),5-HD组(氧化应激+尼可地尔+5-HD)。20%胎牛血清加入Media199培养基制备细胞培养液,青霉素与链霉素的浓度为100uL-1及0.1mgL-1;终浓度为0.25%胰蛋白酶溶于平衡盐溶液后,过滤除菌,用于细胞消化传代。细胞置5%CO2、37培养。氧化应激暴露前,内皮细胞重悬于含血清的M199培养基,以每孔5103密度接种于96孔板。24h后,吸走培养液,PBS冲洗2次,MTT溶液染色10min,PBS再冲洗3次,分光光度计测量波长为570nm的A值。在培养基中,加终浓度为100molL-1的H2O2溶液;将体外培养的人脐静脉内皮细胞氧化应激暴露,同时分别加入100molL-1尼可地尔及500molL-15-HD[5]。氧化暴露后的24,48及72h重复实验,各组在每个时间点测6孔。绘制细胞增殖曲线。Hoechst33258细胞染色氧化应激暴露48h后,收集各组细胞。常规细胞涂片后,4%多聚甲醛室温固定30min。PBS冲洗3遍后,2gmL-1的Ho-echst33258染色液孵育30min。PBS充分洗脱未穿透细胞膜的染料,352nm波长激发光激发后,荧光显微镜下观察并照相。流式细胞仪实验氧化应激暴露48h后,细胞消化收集后,用PBS液充分冲洗,以去除胰酶。内皮细胞重悬于AnnexinV-FITC结合液,加入An-nexinV-FITC(终浓度为2.5%),室温避光孵育10min,1000g离心后弃上清,再加AnnexinV-FITC结合液重悬细胞,随后加碘化丙啶染色液(终浓度为5%),轻混,4避光放置10min后,进行流式细胞仪检测。内皮细胞NO水平测定[6]DAF-FM/DA荧光染色溶液(浓度为5molL-1)用于预处理内皮细胞,20min后,用PBS冲洗。490nm激发光波长激发,510nm波长下荧光显微镜实时记录DAF-FM/DA荧光强度变化。10nmolL-1缓激肽用于激发内皮细胞NO的生成[7]。绘制NO生成曲线,用内皮细胞内NO浓度变化评价内皮细胞的功能状态。3统计学分析用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验各组间增殖曲线及NO浓度变化曲线;t检验用于

参考文献

引证文献

问答

我要提问