27种中药提取物抑制血管生成活性的评价

作者:陈锡强;彭维兵;侯海荣;王希敏;刘可春;韩利文;袁延强 刊名:山东科学 上传者:黄鑫晨

【摘要】对27种中药分别采用石油醚、乙酸乙酯、水进行系统提取,利用转基因斑马鱼对提取物进行血管生成抑制活性检测。提取物处理斑马鱼胚胎24 h后,统计斑马鱼节间血管(ISV)的生长情况,并计算抑制率;部分有活性的提取物进一步采用鸡胚尿囊膜(CAM)实验进行验证。实验结果显示,川芎水提物、白芍乙酸乙酯提取物、竹黄水提物、鬼箭羽乙酸乙酯提取物和水提物、乳香水提取物、大青叶乙酸乙酯提取物显示出抑制血管活性现象;其中川芎水提取物、鬼箭羽乙酸乙酯和水提物、乳香水提取物对鸡胚尿囊膜血管生成具有明显的抑制作用。从27种中药中发现了7种提取物具有抑制转基因斑马鱼节间血管生长的作用,这种作用与血管内建生长因子受体2(VEGFR2)表达有关。

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中草药的抗肿瘤作用通过药理实验研究已经得到证实[1-2],其作用机制包括诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成和提高机体免疫等方面。近年来,抑制血管生成已经成为抗肿瘤的一种新疗法,但是,在中药材中进行系统性抑制血管生成的研究还鲜有报道,我们利用转基因斑马鱼模型对多种传统中药材提取物进行活性筛选,以期获得有价值的中药提取物。斑马鱼是近年来公认的最适合用于抑制血管生成和血液病药物筛选的模式动物。在斑马鱼早期发育的过程中胚胎透明,可直接观察到各组织器官。由于斑马鱼血管生成的方式比较简单,在显微镜下就能够观察到节间血管、血流和红细胞的形态,因而被用于血管形成方面和血液类疾病药物筛选。血管荧光标记的转基因斑马鱼可以清晰地进行斑马鱼节间血管的计数[3],方便地考察药物的抑制血管生成作用。本实验利用转基因斑马鱼测定了27种中药材提取物的抑制血管生成活性,并采用鸡胚尿囊膜实验对发现的部分活性提取物进行了验证。1材料:1.1转基因斑马鱼Tg(VEGFR2:GFP)系,本实验室繁殖。7d鸡胚蛋由济南滋平家禽养殖有限公司提供。1.2实验样品与试剂实验用中药材均购自济南建联中药店,经鉴定后使用。实验用有机溶剂均为分析纯。27种中药材各500g,提取过程:药材经过粉碎后,用石油醚回流提取3次,提取液过滤后浓缩干燥即得到石油醚部位;药渣挥去溶剂,再用乙酸乙酯1:5回流提取3次,提取溶液过滤后浓缩干燥得到乙酸乙酯部位;再用蒸馏水回流提取3次,水液浓缩干燥后得到水溶液提取物。阳性对照PTK787(Sigma出品,纯度>96%)用二甲基亚砜溶解,用水稀释成终浓度100gmL-1的溶液(二甲基亚砜终浓度为0.1%),置冰箱中备用。1.3主要实验仪器OLYMPUSSZX16体视荧光显微镜(日本奥林巴斯公司);COIC倒置荧光生物显微镜XDS-1B(重庆光学仪器厂);LRH-250-G光照培养箱(广东医疗器械厂)。2斑马鱼血管生成抑制实验斑马鱼的养殖和培育参照Westerfield的方法[4]。选择成熟斑马鱼雌雄一对,傍晚时放入培育缸中,第二天早上产卵后取出受精卵置新鲜培养水中,28光照培养箱备用。鱼胚胎于受精24h(hoursofpostfertilization,hpf)后取出,置于1gmL-1链霉蛋白酶溶液中脱去卵膜,将脱膜胚胎加入96孔板中,每孔一只;将石油醚部位、乙酸乙酯部位和水提物分别加入96孔板中,每种提取物各8个胚胎;对照组8个胚胎,加培养水,其中二甲基亚砜的体积分数为0.1%,不加入任何药物;PTK787为阳性药物组,终浓度为10gmL-1。加药后将96孔板放入光照培养箱继续培养,加药24h后,加入体积分数为1三卡因溶液麻醉鱼体,在荧光显微镜下观察记录斑马鱼血管荧光表达强弱状况,并对体节间血管(ISV)计数。血管抑制率的计算:抑制率=对照组平均血管数-实验组平均血管数对照组平均血管数100%。3鸡胚尿囊膜血管生成实验选择7d龄活胚蛋,随机分组,每组15个,在照卵灯下寻找胚头中轴侧区域,划定1cm1cm圆形开窗部位,用体积分数为75%乙醇溶液消毒开窗部位,在鸡胚气室端钻2mm小孔并穿透壳膜。暴露出鸡胚尿囊膜,用微量进样器将各组药物滴加入甲基纤维素滤膜中,将滤膜放置于尿囊膜上血管部位,给药方式为:对照组为每个鸡胚生理盐水20L,4组中药提取物组为各提取物100g/个,加药完毕后用胶带密实封口。并继续放入37C的孵箱内孵育72h。新生血管数量计算:揭开透明胶带,加满质量分数为4%多聚甲醛,室温下原位固定30min。待CAM上血管内的血液凝固后,揭去封窗的透明膜,剪除CAM以上的蛋壳

参考文献

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