恒河猴糖尿病动物模型血清及组织中细胞因子的变化

作者:朱华;徐艳峰;刘颖;黄澜;秦川 刊名:中国实验动物学报 上传者:乔亮

【摘要】目的探讨恒河猴糖尿模型病细胞因子的水平和变化规律。方法健康恒河猴5只,小剂量(30mg/kg)多次静脉注射链脲佐菌素(STZ),血糖稳定后3、9、12和19个月检测血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。安乐濒死状态的动物,取胰腺、肝脏、肾脏制成石蜡切片,用免疫组化染色法显示组织中IL-6、IL-10、TNF-α的表达,并对结果进行图像分析和统计学处理。结果造模后9个月动物血清中IL-10浓度显著降低(P<0.01)。IL-6、TNF-α水平在采样的各个时间点均显著高于造模前(P<0.01)。胰腺组织中IL-6中等强度着色,对照组弱阳性表达(P<0.05)。对照组IL-10强阳性表达,模型组弱阳性(P<0.01)。模型组TNF-α中等强度表达,对照组弱阳性(P<0.05)。模型组肝脏组织TNF-α中等阳性表达,对照组弱阳性(P<0.05)。结论小剂量多次注射STZ后恒河猴细胞因子的含量及变化与临床类似,可作为相关研究的动物模型。

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糖尿病发病机理与众多因素有关,慢性低度炎症在糖尿病发生机制中的作用越来越引起人们重视。研究证明,在糖尿病患者中白细胞介素6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-)等前炎症细胞因子的血清水平发生了明显变化[1-3],提示前炎症因子通过促进机体炎症反应参与了糖尿病的发病过程。小剂量多次注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)是常用的建立糖尿病动物模型的方法。其所诱发的糖尿病目前认为是由免疫机制引起的。STZ诱导的恒河猴糖尿病模型细胞因子水平如何,其变化规律是否与临床病人相似?本研究通过观察恒河猴糖尿病动物模型血清中及组织中这3种细胞因子的含量变化。探讨它们在恒河猴糖尿病的发生、发展和预后判定中的作用,为模型应用提供参考。1材料与方法1.1模型制备成年恒河猴5只,购自军事医学科学院实验动物中心【SCXK-(军)2007-001】,年龄46岁,体重5.56.5kg。动物实验在中国医学科学院医学实验动物新药安全研究评价中心进行【SYXK(京)2010-003】,模型制作方法见参考文献[4]。1.2血清样本动物血糖稳定后3、9、12和19个月,禁食12h后于清晨采集静脉血离心,用ELISA方法检测血清中IL-6、IL-10和TNF-含量。1.3组织样本1.3.1组织样本制备3只模型动物在给予STZ后19个月,1只动物在给予STZ后20个月时于精神状态萎靡,不进食。经兽医诊断后决定给予安死术:动物经戊巴比妥麻醉后股动脉放血。取胰腺、肝脏、肾脏等,4%中性甲醛固定24h后梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。樱花IVS410切片机连续切片,厚度4m。每隔5片取连续的3片贴在经多聚赖氨酸处理的载玻片上,50烤箱内烘烤过夜。以长期毒性试验正常对照组动物的胰腺、肝脏、肾脏做对照,组织切片的处理与模型动物相同。1.3.2免疫组化染色组织切片经脱蜡、水化后,用SP法进行免疫组化染色。具体步骤:1)3%双氧水消除内源性过氧化物酶,室温10min,PBS洗。2)正常羊血清室温封闭15min,不洗,直接加一抗:加IL-6(Abcam,货号ab6672,1400稀释)、IL-10(Abcam,货号ab34843,1400稀释)和TNF-(Abcam,货号ab1793,150稀释)4过夜,PBS洗3次。3)分别加抗小鼠、抗兔的二抗(北京中杉金桥,货号PV-9001,PV-9002),室温孵育30min,PBS洗3次。4)DAB显色(北京中杉金桥,货号ZLI-0001),显微镜下控制显色程度,蒸馏水终止显色。6)苏木素衬染后脱水、透明、中性树胶封片。1.4数据统计1.4.1免疫组化结果用Aprieo切片扫描系统扫描切片整张切片,随机取5个高倍视野(400),用Image-ProPLUS图像分析软件统计IL-6、TNF-和IL-10的阳性细胞数和吸光度值(IOD)。每只动物计数3张切片,取平均值。1.4.2数据分析用SPSS16.0统计软件处理,结果用x珋s表示,两组间比较使用t检验各指标的相关性用线性回归分析,P<0.05有统计学意义。2结果2.1血清样本与造模前比较,5只模型动物血清中IL-10浓度在3个月时差异无显著性,9个月降低,差异有显著性(P<0.05)。IL-6和TNF-含量在采样的各个时间点均增高,差异有显著性(P<0.01)。中国实验动物学报2013年6月第21卷第3期ActaLabAnimSciSin,June,2013,Vol.21.No.3表1造模前后血清中IL-6、IL-10TNF-的变化Tab.1Changesofser

参考文献

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