烟草青枯菌拮抗放线菌的筛选及鉴定

作者:陆铮铮;彭丽娟;丁海霞;左希;彭杰;蒋选利 刊名:中国烟草科学 上传者:蒋伟

【摘要】为筛选出烟草青枯菌的有效拮抗菌,本研究从烟草根围土壤中分离了97株放线菌,通过平板对峙培养法筛选出抑菌圈直径均达20 mm以上的拮抗放线菌3株。根据其在鉴别培养基上的培养特征、孢子和孢子链的形态特征,生理生化特性以及16SrDNA序列分析对这3株拮抗放线菌进行鉴定。结果表明,3株拮抗放线菌都属于链霉菌属(Streptomyces),分别为粉红孢类群中的玫瑰暗黄链霉菌(S.roseofulvus Preobrazhenskaya)、绿色类群中的橄榄绿链霉菌(S.olivaceoviridisPreobrazhenskaya)和灰褐类群中的黄麻链霉菌(S.corchorusii Ahmed)。其中,玫瑰暗黄链霉菌菌株对青枯劳尔氏菌的拮抗效果最好,其平均抑菌圈直径可达54.66 mm;橄榄绿链霉菌菌株的拮抗效果次之,其平均抑菌圈直径为43.20 mm;黄麻链霉菌平均抑菌圈直径为20.34 mm。

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烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanaceanm)侵染引起的细菌性土传病害,是烟草上的一大毁灭性病害。在我国南方烟区普遍发生,在贵州省,该病害广泛发生和流行,且较难防治。目前仍以化学防治为主[1],农药虽然在防治植物病害方面发挥了重要的作用[2],但污染环境,对人畜安全造成威胁。人们施用农药更加慎重,越来越倾向于使用绿色的生物防治措施,生物防治的研究和开发已成为防治青枯病的重点和热点[3]。研究发现,土传病害是由于土壤中众多微生物种类间的不平衡竞争和繁殖所导致[4]。向烟田土壤施入有益微生物,使这些有益微生物在土壤中大量生长和繁殖,竞争病原菌的营养和生存空间。因此,分离和筛选原位土壤中的拮抗菌,能增强定植能力,提高防治效果。放线菌能产生抗菌素,对许多细菌和真菌都具有较强的抑制作用。本研究从贵州省烟草主产区,分离和筛选青枯病发病烟田健康植株根围土壤中的拮抗放线菌,并鉴定。为控制烟草青枯病提供理想的生防菌。1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株2010年7月在贵州省天柱县社学乡平莆村烟田中采集烟草青枯病病株,采用平板划线分离法分离,纯化。依据文献[5]鉴定病原菌。用醮根接种法做回接试验,发病后,再进行病原菌的分离和纯化,采用灭菌蒸馏水保存方法保存备用[6]。1.1.2土壤样品2010年8月在贵州麻江县五寨乡、黄平县白塘村以及大方县双山镇等地,选取发生青枯病的烟田采集健康烟株的根围土壤共12份。1.1.3培养基1)分离和对峙培养病原菌的分离和培养即肉汁冻培养基(NA);土壤放线菌的分离即高氏合成1号培养基;纯化即燕麦粉培养基;平板对峙即马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。2)拮抗放线菌的鉴定培养特征及形态特征所用培养基[7]为国际链霉菌计划(ISP)所指定的7种培养基即甘油天冬素琼脂培养基(ISP-2)、无机盐淀粉琼脂培养基(ISP-3)、酵母精麦芽糖精琼脂培养基(ISP-4)、燕麦粉琼脂培养基(ISP-5)、高氏合成1号培养基、Czapck培养基和马铃薯浸汁培养基。生理生化特征所用培养基[8]为明胶液化培养基、牛奶凝固与胨化培养基、淀粉水解琼脂培养基、纤维素水解培养基、H2S产生培养基、碳源利用的基础培养基(选用的碳源分别有L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、L-鼠李糖、蔗糖、棉子糖、D-甘露醇以及L-肌醇)1.2方法1.2.1病原菌的分离取病株发病部位一小块组织(0.5cm0.5cm)制成临时装片,用显微镜观察有无喷菌现象,观察到喷菌现象后,采用平板划线分离法[9]分离。1.2.2土样采集选取种植年限较长且发病较重的烟田,采集健康烟株的根围土壤。取样时拨开表土约5cm深,每样约50g(同地区取样点至少相距100m以上),装入自封袋并做上记号,带回实验室。1.2.3土壤放线菌分离方法参照文献[9]。1.2.4对峙培养筛选平板喷雾法:将放线菌接种于PDA平板中央,于28培养箱培养7d后,用无菌的喉头喷雾器将浓度为3108cfu/mL的烟草青枯菌悬液喷入PDA平板上,静置20min后,将平板倒扣于30培养箱培养,24h后观察并测量抑菌圈的直径。以PDA平板上不接任何菌做对照。初筛时做3个重复,挑选出效果较好的放线菌进行复筛,复筛时做5个重复[10]。1.2.5拮抗放线菌鉴定1)16SrDNA序列分析采用改良的CTAB法提取放线菌的总DNA[11],由上海捷瑞生物工程有限公司合成的细菌16SrDNA通用引物做16SrDNA片段扩增。(Bio-Rad梯度PCR仪,型号为BIO-RADPACIFICLTD,USA,BIO-RAP)

参考文献

引证文献

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