HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

作者:马健娟;何志旭;舒莉萍;姚冬静;李莉;李燕 刊名:四川大学学报(医学版) 上传者:叶星

【摘要】目的探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础。方法提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交。结果构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达。结论得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础。

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同源盒(homeobox,HOX)基因,最初是在果蝇中发现,具有同源结构域,包含高度保守的180bp的序列,编码60个氨基酸,对胚胎的发育具有重要的调节作用[1]。其中一些同源盒基因作为重要的转录因子,是转录的激活剂或抑制剂。爪蟾的HOX基因调控胚胎期的发育,影响其原始造血祖细胞的分化[2]。有研究表明,小鼠的HOX基因[3]不仅在胚胎发育中发挥作用,并且在造血发育和分化中以种系特异性和阶段特异性的方式起调控作用,其中HOXC4基因作为HOX基因家族中的一员,在小鼠淋巴细胞有表达,并且具有细胞特异性。Daga等[4]通过细胞培养及杆状病毒转染技术,证实人类CD34+细胞中有HOXC4的表达,并且过表达HOXC4可导致早期原始造血祖细胞数目增加,红系集落的增加更明显,但并不引起髓系祖系集落的增加。为进一步了解HOXC4在活体动物体内的表达情况,及其与造血发育的相关性。本研究以斑马鱼为模型,探讨HOXC4在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式。1材料与方法1.1实验动物实验用野生型斑马鱼Tuebingen由上海生命科学院刘廷析教授馈赠,参照Westerfield[5]方法进行饲养,按雌雄12或者11放入交配缸内,次日清晨收集斑马鱼受精卵,对受精卵进行清洗后,移入斑马鱼受精卵培养用水中置于28.5生化恒温培养箱中培养。1.2主要试剂及仪器实验所需pCS2+质粒由上海生命科学院刘廷析教授馈赠,DH5菌为本课题组保存,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,KOD-PLUSDNA聚合酶(TOYOBO公司),限制性内切酶及T4DNA连接酶(fermentas公司),质粒小抽试剂盒(Axygen公司),T3酶及RNA柱纯化试剂盒(Ambion公司),DIGRNAlabelingmix及Anti-digoxigeninAP-conjugate(Roche公司),BCIP/NBTAlkalinephosphataseKitIV(VECTORLABORATORIES公司),杂交炉(美国UVP公司HL-2000),生物学显微镜(NikonSMZ645),Trizol(invitrogen公司),紫外分光光度计(岛津UV1700),LRH系列生化培养箱(上海一恒科技有限公司)。1.3实验方法1.3.1斑马鱼总RNA的提取及cDNA的制备收集野生型斑马鱼Tuebingen受精后0120h(hourspostfertilization,hpf)之间11个时相的胚胎,用TRIzol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测其完整性及纯度后,利用随机引物法逆转录合成cDNA,-20保存备用。1.3.2PCR体外扩增目的基因片段根据斑马鱼cDNA文库中HOXC4基因组序列,用PrimerPremier5.0软件设计引物,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,正向引物:5-CGGGATCCAAGCATCCCTGAGCCTGAT-3反向引物:5-CGGGATCCAAGCATCCCTGAGCCTGAT-3,上下游引物5端分别加有酶切点BamH和Xho及保护碱基,经RT-PCR扩增后可见380bp大小的目的条带,对其进行纯化后,-20保存备用。1.3.3HOXC4-pCS2+重组质粒的构建将克隆得到的HOXC4基因片段和pCS2+分别用限制性内切酶双酶切,经纯化后,用T4DNA连接酶把HOXC4基因片段插入到pCS2+载体中,筛选氨苄抗性阳性的克隆。1.3.4HOXC4-pCS2+重组质粒的鉴定用BamH和Xho对重组质粒进行双酶切;以重组质粒为模板,对目的基因进行PCR扩增;将重组质粒

参考文献

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