Aβ对大鼠海马细胞钙浓度和线粒体膜电位影响

作者:吴艳萍;马若波;郑晶;任锐 刊名:中国公共卫生 上传者:曾纯一

【摘要】目的探讨β-淀粉样蛋白(Aβ25~35)对原代培养大鼠脑海马细胞内游离钙离子浓度和线粒体膜电位影响。方法原代培养8 d的SD大鼠脑海马神经细胞,利用老化的Aβ25~351、10和20μmol/L对其染毒,分别观察染毒后24、48和72 h时海马细胞形态改变、细胞内游离钙离子浓度和线粒体膜电位。结果随着染毒剂量增加,海马神经细胞开始变形、萎缩、神经元胞体模糊,突起变细、变短、分支减少,边缘模糊,神经网络破裂中断;电镜结果显示,随着染毒剂量增加和染毒时间延长,海马细胞凋亡比例增加;20μmol/L Aβ25~35染毒24、48和72 h后,细胞内Ca2+浓度分别为(30.79±1.28)、(38.19±2.13)和(41.65±3.60),细胞内线粒体膜电位分别为(46.94±9.55)、(39.98±6.51)和(34.52±5.67),与对照组比较,Ca2+浓度均升高,膜电位均降低(P<0.01)。结论 Aβ25~35可以通过破坏细胞内钙稳态和线粒体膜电位而发挥神经毒性作用。

全文阅读

阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是引起老年痴呆的最常见原因之一[1],是目前在世界范围内老年人的常见病和多发病。在AD的发病机理研究中发现,-淀粉样蛋白(A2535)的过量沉积是其主要病因之一。近来越来越多的研究证明A2535在AD的发生、发展中起着主导作用,它可引起神经元细胞的凋亡和坏死[2]。但是对于A2535的毒副作用机制研究结果尚不一致,本研究拟通过观察A2535对大鼠原代培养的海马神经细胞内游离钙浓度和线粒体膜电位的影响,探讨A2535的神经毒性机制,结果报告如下。1材料与方法1.1实验动物新生13dSD大鼠(哈药集团制药总厂),20只,雌雄不拘。实验动物使用许可证号:SCXK(黑)2006-007。1.2主要试剂A2535、神经生长因子(-nervegrowthfactor,-NGF)、胰蛋白酶、谷氨酰胺、阿糖胞苷、Hoechst33258荧光染料(美国Sigma公司);达尔伯克改良伊格尔(Dulbecco'smodificationofEagle'smediumDulbecco,DMEM)培养基、B-27添加剂(美国Gibco公司);马血清、胎牛血清(美国Hyclone公司);L-多聚赖氨酸、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)兔多克隆抗体、免疫组化(streptavidin-biotincomplex,SABC)试剂盒(武汉博士德公司);二氨基联苯胺(3,3’-diami-nobenzidine,DAB)显色剂(北京中山公司)。接种培养液:DMEM培养基87%,胎牛血清10%,200mmol/LL-谷氨酰胺储备液1%,1万单位/mL青链霉素储备液1%,1g/mL-NGF储备液1%;维持培养液:DMEM75%,马血清10%,胎牛血清10%,200mmol/LL-谷氨酰胺储备液1%,1万单位/mL青链霉素储备液1%,1g/mL-NGF储备液1%,B-272%。1.3指标与方法1.3.1海马细胞原代培养鉴定与分组取新生13d的SD大鼠,75%乙醇消毒;断头,分离海马;用2.5g/L胰蛋白酶37消化30min;1000r/min离心5min;制备细胞密度为5105个/mL细胞悬液,接种到内有盖玻片的35mm培养皿中(培养皿事先用1mg/mL多聚赖氨酸处理),375%CO2孵箱中培养24h,改用维持培养液培养;第3d在培养液中加入阿糖胞苷储备液(终浓度为5mol/L)抑制胶质细胞生长。应用SABC法检测NSE抗体表达。配制0.2mol/LA2535,封口膜封好,置37下孵育7d,使其老化、聚集。-20储存备用。取培养8d的细胞进行实验,染毒终浓度设为0(对照)、1、10、20mol/L,分别培养24、48、72h。1.3.2A2535染毒对原代培养海马神经细胞病理影响细胞培养结束后,在倒置显微镜下观察细胞形态,并拍照。在4%戊二醛中固定48h;乙醇梯度脱水;再用1%四氧化锇固定1h;用Epon812环氧树脂包埋;JEM-1220透射电子显微镜(日本奥林巴斯公司)下观察。1.3.3海马神经元细胞内游离钙离子浓度检测Fluo-3/AM用二甲基亚砜配成1mmol/L母液,分装、避光、-20保存。使用前用细胞培养液将储备液稀释成10mol/LFluo-3/AM工作液。选取镜下生长良好细胞,弃去培养液,用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline,PBS)洗涤3遍,每个培养皿中加入0.5mL的10mol/LFluo-3/AM工作液,37负载45min。吸去Fluo-3/A

参考文献

引证文献

问答

我要提问