正交设计优化香菇多糖酶解法提取工艺的研究

作者:王景翔;王娟;赵建录;马晓;刘富 刊名:时珍国医国药 上传者:田颖辉

【摘要】目的筛选酶法提取香菇多糖的最佳工艺条件,以改善工艺、提高收率。方法采用中性蛋白酶酶解法提取干香菇中的多糖,考察酶的用量、酶解温度、酶解pH及酶解时间对提取液中多糖含量的影响,并采用正交实验优选提取工艺条件。结果香菇多糖的最佳提取工艺条件:酶与干香菇粉的配比为1∶30,酶解温度40℃,酶解pH7.5,酶解时间90 min。结论该方法操作简便、条件温和、时间周期短、提取收率高。

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香菇是食用兼药用菌,自1970年日本千原羽田从香菇中分离出抗肿瘤的多糖后,引起了研究的热潮。香菇多糖(Lentinan)具有健胃保肝、降血糖、降血脂、抗肿瘤和提高免疫功能,以及抗衰老、抗感染、抗辐射、抗毒物、抗水肿、祛痰镇咳等方面的功效[13]。它是极性大分子的化合物,常规方法多采用不同温度的水、稀碱或盐溶液提取,但在酸性条件下可引起糖苷键的断裂。因此,采取超声波辅助下的酶提取法等,能够节省大量能耗和时间,而且多糖的提取率也比传统方法要高[4,5]。1仪器与试剂1.1仪器FW80万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司;KQ2500DE型数控超声波仪,昆山市超声仪器有限公司;UV-1800紫外可见光度计,日本岛津公司。1.2试剂干香菇,本地农贸市场购得;中性蛋白酶,60000U/g,北京奥博星生物技术有限责任公司;无水葡萄糖,河北圣雪葡萄糖有限责任公司;苯酚、浓硫酸、95%乙醇、氢氧化钠、盐酸均为分析纯试剂。2方法与结果2.1提取工艺取干香菇适量,置万能粉碎机中粉碎后过20目筛;称取适量粉末加入20倍蒸馏水搅拌使成混悬液,加入超声仪中室温下超声处理30min。将混悬液取出后加入中性蛋白酶进行酶解;灭酶活,过滤得澄清滤液,旋转蒸发,浓缩至原体积的25%,加入1倍量的95%乙醇,即得到絮状沉淀,过滤,用少量无水乙醇洗涤,真空干燥,即得香菇多糖粗品。2.2含量测定选择葡萄糖为对照品,采用苯酚-硫酸法,在490nm波长下以紫外分光光度法进行多糖含量的测定[6]。2.2.1溶液的配制苯酚溶液的配制:精密称取苯酚6g,用适量蒸馏水溶解,置于100ml容量瓶中稀释至刻度,摇匀,即得6104mgL-1的苯酚溶液,备用。葡萄糖对照品溶液的配制:精密称取无水葡萄糖50mg,置于100ml容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,配制成500mgL-1的葡萄糖对照品储备液;精密吸取1ml加入100ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,即得5mgL-1的葡萄糖对照品溶液。2.2.2线性范围及标准曲线的绘制精密吸取葡萄糖对照品储备液各0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8ml,分别加入100mL容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度,摇匀;精密吸取上述溶液各2.0ml置于具塞试管中,分别加入苯酚溶液1.0ml及浓硫酸5.0ml,充分摇匀;置50水浴中保温20min,冷却至室温,在490nm波长处测定吸光度;同时以2.0ml蒸馏水同法操作为空白溶液,以吸光度度(A)为纵坐标,葡萄糖浓度(C)为横坐标进行线性回归,所得回归方程为:A=0.0518C+0.328,r=0.9995;表明在29mgL-1范围内呈线性关系。绘制的标准曲线见图1。图1标准曲线图2.2.3测定方法精密称取香菇粗多糖粗品5mg,少量热蒸馏水溶解后,冷却、移至100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀;精密吸取1.0ml稀释至100ml,依“2.2.2”中方法测定吸光度,计算香菇多糖含量。2.3正交实验在单因素实验的基础上,设计考察酶用量(A)、酶解温度(B)、酶解pH(C)、酶解时间(D)对多糖提取收率的影响。每因素各取3个水平进行正交试验设计,见表1;按L9(34)表组合实验,结果见表2;另对其进行方差分析,结果见表3。表1正交实验因素与水平因素A酶用量*B酶解温度/C酶解pHD酶解时间/min1140305.5802130406.5903120507.5100*酶用量=酶:干香菇粉(w/w)表2正交试验因素与水平No.ABCD提取收率(%)111113.77212225.19313335.74421236.

参考文献

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