Cyclin D1调控U87胶质瘤细胞周期研究

作者:章倩倩;周惠;屈良鹄;王丽京 刊名:中国现代医生 上传者:华峰

【摘要】目的探讨细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)在U87胶质瘤细胞周期调控中的作用。方法根据NCBIGenBank中cyclin D1序列设计双链siRNA,利用Western blotting技术验证设计的siRNA序列的有效性,并通过流式细胞术检测抑制CCND1对U87胶质瘤细胞周期进程的影响。结果经Western blotting检测,成功抑制了CCND1的表达。并且抑制CCND1后,U87细胞周期停滞在G1期,抑制了U87细胞的G1/S期转换。结论 U87细胞中抑制CCND1可以显著抑制细胞周期进程,使细胞周期停滞在G0/G1期,为进一步研究胶质瘤的靶向治疗奠定了理论基础。

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人类神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,发病率高,约占成人颅内肿瘤的40%50%[1],通过传统的手术、化疗及放疗等治疗预后极差[2]。细胞周期是细胞生命活动的基本过程,目前的研究表明肿瘤的发生和发展与细胞周期分子调控的异常密切相关。细胞周期蛋白D家族(CyclinD)包括CyclinD1(CCND1)、CyclinD2和CyclinD3,其中CyclinD1与肿瘤周期调控密切相关[3-5]。大量研究证实,胶质瘤中存在CyclinD1过表达,并且其表达程度与肿瘤恶性程度和患者预后相关[6-10]。然而,CyclinD1在胶质瘤中是否调控肿瘤细胞周期进程报道较少。因此,确定Cy-clinD1对胶质瘤细胞周期的调控机制,有助于进一步研究以CyclinD1为靶点的药物对胶质瘤进行治疗。1材料与方法1.1细胞株人类神经胶质瘤细胞株U87,贴壁培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的DMEM高糖培养基,置于5%CO2培养箱中37培养。待细胞生长至80%90%融合后传代培养,取38代处于指数生长期的细胞进行试验。1.2试剂和仪器DMEM高糖培养基,胎牛血清,0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司);cyclinD1siRNA由上海吉玛公司合成;CC-ND1一抗(SantaCruz,美国);Nocodazole(Sigma公司)。CO2培养箱(Thermo,美国);倒置显微镜(Olympus,日本)。1.3方法1.3.1细胞分组及转染处理取指数生长期细胞接种于6孔细胞培养板,3105个细胞/孔,分为正常生长组、空白对照组和siRNA组。24h以后对细胞进行转染,具体实验方案参考LipofectaminTM2000产品使用说明书。细胞接种24h后吸取培养基,加入无血清无双抗的DMEM培养基2mL。准备转染复合物,溶液A:250LOpti-MEM培养基+5LLipofectaminTM2000,溶液B:250LOpti-MEM培养基+50mol/LsiRNA,室温下分别静置5min。然后将溶液A与溶液B混合,室温静置20min后加入细胞中。放入CO2培养箱静置培养,6h后换成含血清和双抗的DMEM培养基。1.3.2蛋白免疫印迹转染siRNA后48h的U87细胞用RIPA裂解蛋白,并用BCA法检测蛋白浓度。每组取60g总蛋白行SDS-PAGE,250V转PVDF膜90min后5%脱周惠2屈良鹄2王丽京11.广东药学院血管生物学研究所,广东广州510006;2.中山大学生物工程中心,广东广州510275CHINAMODERNDOCTOR中国现代医生脂奶粉室温封闭1h,4一抗封闭过夜,TBST洗涤10min3次,然后将HRP标记二抗室温孵育1h,再次TBST洗涤10min3次后ECL法发光,暗室曝光、显影、洗片。1.3.3流式细胞术检测细胞周期在转染siRNA后24h的U87细胞中加入100ng/mLNocodazol将细胞周期同步化;继续培养20h,收集细胞培养液及细胞,500g离心5min收集细胞,1PBS洗两次;加入冰冷的NP40/PI染液及25mg/mLRNaseA,37水浴30min;通过300目筛网过滤入流式管中,上机检测。1.3.4数据处理与分析细胞周期分布用Modfit3.0软件(VeritySoftwareHouse,Topsham,ME,USA)分析。实验采用三次独立实验结果数据进行统计,所得数据用统计学软件SPSS进行分析,数据以均数标准差(xs)表示,在进行两组之间的差异分析时选用双尾Student’st-te

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