人骨髓间充质干细胞对小鼠神经干细胞增殖与分化培养的影响

作者:陈玉;吴秦洁;李舍予;张勇刚;胡火珍 刊名:四川大学学报(自然科学版) 上传者:毕金杰

【摘要】通过在体外培养、鉴定人的骨髓间充质干细胞与小鼠神经干细胞,用骨髓间充质干细胞条件培养基分别在增殖与分化条件下对神经干细胞进行培养。发现,间充质干细胞条件培养基在增殖条件下能加快神经球内神经干细胞的迁移,使神经球解聚,对神经干细胞增殖没有影响;而间充质干细胞条件培养基在分化条件下,能增加神经干细胞向少突胶质细胞分化的能力,降低向星型胶质细胞的分化能力,对向神经元分化能力没有影响,间充质干细胞可能是通过促进神经干细胞迁移、分化而加快神经损伤的修复的。

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四川大学学报(自然科学版)第46卷1引言间充质干细胞(mesenehymalstemcells,MSC。)是一种具有多向分化能力的成体干细胞[l1.在实验中发现,间充质干细胞移植能改善骨缺损修复闭,心肌缺损修复川,神经损伤修复等闭,但间充质干细胞在移植区起了什么作用,还不清楚.神经干细胞(neuralStemcells,NSCs)是存在于神经系统,具有自我更新与多向分化潜能的细胞,在体外培养时能形成含有神经干细胞的神经球,在神经损伤修复过程中起重要的作用川.神经损伤是一种比较难修复的机体损伤,神经干细胞移植能改善神经损伤的修复,但神经干细胞与间充质干细胞的共移植更能加快修复过程[6j.有可能是间充质干细胞分泌的相关因子对神经干细胞产生影响,加快神经损伤的修复.为了验证我们的推测,分别在神经干细胞增殖和分化培养条件下,利用人骨髓间充质干细胞(hMSCS)条件培养基培养神经球,观察其对神经干细胞的影响,为间充质干细胞的应用提供实验依据.2材料与方法2.1实验材料人骨髓于四川大学华西医院,采集于健康的自愿者.受孕14d的C57小鼠由四川大学基因工程小鼠中心提供.神经干细胞增殖培养基、神经干细胞分化培养基、神经球化学离解试剂盒、表皮生长因子EGF购自加拿大StemCell公司.CD29-FITC、CD34一FITC、CD44一FITC、CD45一FITC、CD105一Fll’C、MAP一2一FITC、MBP一FITC、GFAP-FITC、FITC标记的同型对照免疫球蛋白购自BD公司.DMEM低糖培养基、胎牛血清、AlexaFluor594羊抗兔二抗、AlexaFluor488羊抗鼠二抗购自Invitrogen公司.Nestin兔源多克隆抗体、MAP一2鼠源单克隆抗体、MBP兔源多克隆抗体、GFAP兔源多克隆抗体购自北京博奥生生物公司.2.2实验方法2.2.1人骨髓间充质干细胞的培养及表面标记鉴定在华西医院利用骨穿刺,采集健康自愿者骨髓smL,放人事先准备好含肝素的smL低糖DMEM无血清培养基,4无菌条件下送至实验室.利用淋巴分离液分离骨髓中的单核细胞,按照1又106个/25cm,密度接种于一次性培养瓶中,加人含10环胎牛血清的低糖DMEM培养基10mL,置于37,5%CO:,相对湿度>95%的细胞培养箱中培养.3~4d后,进行半量换液;到第7d时,进行全换液;到15~18d,细胞克隆逐渐增大,原代细胞约长满瓶底的80%时,进行传代培养.当传至第三代,按照抗体说明书,进行细胞表面标记CD29、CD34、CD44、CD45、CDIOS的流式细胞仪检测.2.2.2小鼠神经干细胞的培养取受孕14.sd的C57小鼠,无菌取出其胎鼠,放人无菌的冰冷D--Hanks液中,洗净血迹.在解剖显微镜下,取胎鼠的纹状体部分脑组织置于含2%葡萄糖的冰冷PBS溶液中,用很细的巴士吸管小心的吹打脑组织,使之分散成单细胞悬液.细胞悬液经75拌m孔径细胞筛过滤后,1509离心5min,用适量神经干细胞扩增培养基重悬细胞,按8又10‘个细胞/cm,接种于25cm,细胞培养瓶,加人含20xl。一99/mLEGF的10mL神经干细胞扩增培养基,置于5%CO:浓度,相对适度>95%的培养箱中培养.传代培养时,用神经球化学离解试剂盒把神经球离解成单细胞悬液后,按照2火10‘个/cm,的密度进行传代培养.2.2.3小鼠神经干细胞的Nestin鉴定与多向分化能力鉴定取培养至第三代的神经球,用神经球化学离解试剂盒得到单细胞悬液,一部分悬液滴片,进行Nestin的免疫荧光染色.另一部分悬液按照lx10

参考文献

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