逆转录聚合酶链反应检测小鼠MN/CA9基因的表达

作者:王银萍;王贵民;薛世泉;邹亚斌 刊名:吉林大学学报(医学版) 上传者:王雪颖

【摘要】目的:克隆、分析ICR小鼠MN/CA9基因序列,并检测MN/CA9基因在ICR小鼠各组织中的表达。方法:分别取ICR小鼠小肠、肝、肾、脾、胃、胸腺、心脏、卵巢、肺、胰腺、肌肉、皮肤、子宫和膀胱新鲜组织,采用胍尼啶异硫氢酸呱酚氯仿提取法(GIT)提取总RNA。合成cDNA的第1链和第2链,连接EcoRⅠ载体,EcoRⅠ末端磷酸化,XhoⅠ消化,将cDNA构建到ZAPexpressvector进行包装、种植培养,筛选、切取噬菌体,使用引物扩增后进行DNA序列分析。用逆转录聚合酶链反应检测小鼠MN/CA9基因在上述组织中的表达。结果:使用人类MN/CA9基因片段做探针,用放射性同位素32P标记探针,筛选1·47×103大肠埃希菌落,杂交后发现一阳性cDNA信号,序列测定确定其含1671bp核苷酸序列(已在GenBank登录,登录号AB086322),这个序列与人类的MN/CA9(基因序列号Z54349)有69·1%的同源性。在引物P521-P1193区间,MN/CA9基因在小鼠小肠、子宫、肌肉、胰腺、心脏、肺、胸腺、脾、肾、卵巢、胃和膀胱组织表达均较强,在皮肤和肝脏不表达。结论:MN/CA9基因在ICR小鼠组织中的表达与人类基本相同,可以用ICR小鼠进行MN/CA9基因的研究。

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MN/CA9基因于1994年由Pasotorek等[1]首次从宫颈癌细胞株Hela中克隆的,是新近发现的碳酸脱水酶家族的成员。值得注意的是研究发现,在许多肿瘤中都有MN/CA9基因的表达,如宫颈癌、宫颈上皮内鳞状上皮瘤变和腺上皮瘤变、肾细胞癌、食管癌、结肠、直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和胆道肿瘤,而且在这些肿瘤相关的正常组织中均无表达[2]。直到最近几年才发现,在人类MN/CA9基因的表达通常仅限于某些正常的上皮组织,如胃肠和胆管上皮、胰腺、睾丸、卵巢、发根的基底细胞、脉络丛和体腔的被覆上皮[3];MN/CA9基因在恶性肿瘤中表达,在良性病变中缺失,因此可以做为良、恶性肿瘤鉴别的指标[4]。目前的研究还发现,MN/CA9基因的表达与肿瘤的预后呈明显的负相关,MN/CA9不仅与EGFR、c-erbB-2和MUC1基因的上调密切相关而且也参与肿瘤的血管生成、凋亡抑制和生长加快。MN/CA9基因被认为在调节细胞增殖和转化中起重要作用[5]。在严重缺氧的条件下,MN/CA9基因的上调作用,MN/CA9基因的表达及肿瘤的侵袭性行为与细胞外基质的酸化有关[6]。尽管对人类MN/CA9基因的的免疫功能已经有一些了解,但是仍然有许多问题需要研究。目前,对MN/CA9基因的研究已引起国外学者的高度关注,而国内还未见相关报道。本研究选择ICR小鼠,一种公认理想的种属,做进一步的研究,试图以人类MNcDNA为探针,从小鼠的小肠里分离和克隆小鼠MN/CA9基因,检测MN/CA9基因在ICR小鼠小肠、肝、肾、脾、胃、胸腺、心、卵巢、肺、胰腺、肌肉、皮肤、子宫和膀胱组织中的表达,为MN/CA9的进一步研究奠定基础。1材料与方法11动物ICR小鼠雌雄各1只,由本校实验动物中心提供,乙醚麻醉下分别取小肠、肝、肾、脾、胃、胸腺、心、卵巢、肺、胰腺、肌肉、皮肤、子宫和膀胱新鲜组织,提取总RNA。12ICR小鼠cDNA文库筛选从ICR小鼠的小肠中提取小肠黏膜,用胍尼啶异硫氢酸呱酚氯仿提取法(GIT)提取总RNA。mRNA的纯化按试剂盒说明操作(购于amershampharmaciabiotech,#27-9258-02UK)。使用ZAPexpresskit(购于Stratagene#200403USA)合成cDNA的第1链和第2链,cDNA平端,连接EcoR载体,EcoR末端磷酸化,Xho消化和包装。使用人类MN/CA9基因片断做探针,用放射性同位素32P标记探针,筛选147103大肠埃希菌落,置杂交缓冲液(50%的甲酰胺、25%的20SSPE、10%的50Denhalts、20%的SDS)内42过夜。在室温下分别用2SSPE,1SSPE和01SSPE洗10min。用同样的方法对阳性噬菌斑进行筛选。用ExAssist辅助噬菌体将插入到pBK-CMV载体的cDNA分离出来,操作程序按供应商提供的指南进行(ZAPexpresskit)。13ICR小鼠cDNA序列分析在20L的反应体系中加入引物5L、cDNA1g、预先配好的Oligo(dT)混合物8L,加水至20L,使用引物,T3顺义5-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3,T7返义3-GGGATATCACTCAGCATAAT-5。PCR循环体系:95、20s,50、15s,60、60s,循环30个周期,对产物冲洗后,取20L应用基因分析仪(PE310-3BiosystemsUSA)测定核酸序列。使用GENETYX-85software(Japan)探索小鼠和人类MN/CA9基因的同源性。14RNA的反转录在10L反应体系中加入1

参考文献

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