组织工程化珊瑚羟基磷灰石人工骨修复骨缺损的实验

作者:韦良臣;尹飚;张余;李纪云 刊名:中国临床康复 上传者:张燕

【摘要】目的:观察以兔骨髓基质干细胞为种子细胞,珊瑚羟基磷灰石人工骨为载体的组织工程化珊瑚羟基磷灰石人工骨修复骨缺损的效果。方法:实验于2004-06/12在广州军区广州总医院动物实验中心完成。选取成年新西兰大白兔24只,随机分为3组,自体骨组,珊瑚人工骨组,珊瑚人工骨-细胞复合体组,每组8只。采集兔骨髓进行基质干细胞分离、体外培养、诱导扩增、同时制备珊瑚羟基磷灰石人工骨,并使之与兔骨髓基质干细胞复合,制备细胞-珊瑚人工复合体。麻醉后无菌制备兔桡骨15mm骨缺损模型,将自体骨,珊瑚人工骨,珊瑚人工骨-细胞复合体分别埋入到骨缺损处,术后2,4,6,8周对动物进行精神状况、伤口和X射线观察。每次观察后随机选择处死2只动物并取材,以组织学方法对成骨情况进行观察。成骨情况按照Lane-SandhuX射线评分标准进行评价。评价内容包括骨形成(0分无骨形成;1分骨形成占缺损25%;2分骨形成占缺损50%;3分骨形成占缺损75%;4分骨形成充满缺损)、骨连接(0分骨折线清楚;2分骨折线部分存在;4分骨折线消失)、骨塑形(0分未见骨塑形;2分骨髓腔形成;4分皮质骨塑形)3个方面11项,采用SSPS8.0统计软件对其分值进行统计处理。结果:24只实验动物均进入结果分析①兔骨髓基质干细胞培养后与珊瑚人工骨贴附能力:体外培养3d时,骨髓基质干细胞已充分贴附包裹于珊瑚孔隙周边,5d与7d时无明显变化。②成骨情况:在手术后2、4、6、8周细胞-珊瑚人工骨复合体组Lane-SundhuX射线评分明显优于自体骨组[(5.4±0.95,8.7±0.51,9.2±2.81,11.2±1.15);(0.7±0.51,2.4±0.96,4.3±0.94,7.2±1.06),P<0.05];明显优于珊瑚人工骨组[(5.4±0.95,8.7±0.51,9.2±2.81,11.2±1.15);(0.3±0.41,1.3±0.43,1.8±0.42,4.5±1.16);P<0.05。在手术后4,6,8周时,自体骨组Lane-SundhuX射线评分优于珊瑚人工骨组(P<0.05)。③各组不同时间炎症细胞数量:细胞-珊瑚人工骨复合体组与自体骨组、珊瑚人工骨组在手术后2,4,6,8周均无明显差异。(P>0.05)。结论:细胞-珊瑚人工骨组的成骨能力最强,自体骨组次之,而珊瑚人工骨组最差。组织工程化珊瑚羟基磷灰石人工骨同时具有骨传导骨诱导作用,成骨能力强,是修复骨缺损的良好方法。

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0引言珊瑚羟基磷灰石人工骨已被应用于修复骨缺损[1]。一些研究证实其具有良好的骨传导作用,但无明显诱导成骨作用。为增强其诱导成骨作用,作者采用组织工程学的方法,以兔骨髓基质干细胞为种子细胞,以珊瑚羟基磷灰石人工骨为载体,制备组织工程化珊瑚羟基磷灰石人工骨,移植到骨缺损处,观察其成骨效果。1材料和方法设计:随机分组的对照观察。单位:北京大学深圳医院骨科。动物:实验于2004-06/12在广州军区广州总医院动物实验中心完成。选取成年新西兰大白兔24只(广州军区广州总医院动物实验中心提供许可证号:军医动字第E98003号),雌雄不限,体质量为2.53.0kg,随机分为3组,自体骨组,珊瑚人工骨组,珊瑚人工骨-细胞复合体组,每组8只。设计、实施、评估者:实验设计为第一作者,具体实施为第一、二作者,评估为全部作者。干预措施:兔骨髓基质干细胞的分离培养、诱导扩增成年新西兰大白兔耳缘静脉麻醉,18号骨穿针自股骨转子部穿刺抽取3mL骨髓,置入肝素化抗凝管中。按Haynesworth等[2]方法,加入含有地塞米松0.01mol/L、-磷酸甘油钠10mmol/L,和抗坏血酸50mol/L的Dulbecco改良的Eagle培养基的成骨条件培养液(Sigma提供),制成细胞悬液。按1106个/cm2有核细胞的密度接种于培养皿中,置于37体积分数为0.05的CO2孵育箱培养。5d后首次换液,使用Dul-becco改良的Eagle培养基成骨条件培养液继续培养,以后每3天换液1次。细胞生长汇合时,用25g/L胰蛋白酶和2g/L乙二胺四乙酸混合液消化,进行细胞传代,继续培养扩增至第3代细胞,备用。倒置相差显微镜连续观察体外培养细胞的生长、增殖、基质分泌和细胞形态的变化。珊瑚羟基磷灰石人工骨的制备及与兔骨髓基质干细胞的复合:实验用珊瑚羟基磷灰石人工骨块的制备同既往研究[1],大小为0.5cm0.5cm1.5cm。超声清洗,高压蒸汽消毒后备用。用Dulbecco改良的Eagle培养基成骨条件培养液将第3代骨髓基质干细胞制成20109L-1的细胞悬液,用注射器吸取滴入珊瑚羟基磷灰石人工骨,确保其完全浸润且不渗漏,制成细胞-珊瑚人工骨复合体,静置于37体积分数0.05的CO2的孵育箱中46h后,再加入Dulbecco改良的Eagle培养液继续培养,7d后回植到骨缺损处。制模及骨植入:麻醉后无菌手术造成大白兔1.5cm桡骨缺损,分别埋入自体骨、珊瑚人工骨、珊瑚人工骨-细胞复合体。术后2,4,6,8周对动物进行精神状况、伤口和X射线观察。每次分别处死2只动物并取材,以组织学方法对成骨情况、炎症反应情况进行观察。按照Lane-SandhuX射线评分标准[2]进行效果评价。评估标准:按照Lane-SandhuX射线评分表准:包括骨形成、骨连接、骨塑形3个方面11项内容。骨形成:0分无骨形成;1分骨形成占缺损25%;2分骨形成占缺损50%;3分骨形成占缺损75%;4分骨形成充满缺损。骨连接:0分骨折线清楚;2分骨折线部分存在;4分骨折线消失。骨塑形:0分未见骨塑形;2分骨髓腔形成;4分皮质骨塑形。主要观察指标:各组按照Lane-SandhuX射线评分标准评估成骨情况。兔骨髓基质干细胞的分离培养、诱导扩增过程中的生长状态。统计学分析:第一作者采用SSPS8.0统计软件进行统计处理。2结果2.1描述性统计2.1.1实验动物数量分析24只实验动物均耐受手术,无死亡,无脱落,全部进入结果分析。2.1.2兔骨髓基质干细胞的分离培养、诱导扩增过程中的生长状态骨髓基质细胞为有核细胞,在培养悬浮液中呈球形,细胞

参考文献

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