丝光绿蝇抗菌肽针刺诱导及初步电泳分离

作者:许兵红;赵春澎;曾莉萍 刊名:中国媒介生物学及控制杂志 上传者:蒋淑莲

【摘要】目的探讨丝光绿蝇抗菌肽的诱导及电泳分离方法。方法丝光绿蝇3龄幼虫针刺体壁诱导后,第48小时提取其血淋巴,设置3、5、7、10μl不同的加样量和pH值6.0、6.5、7.0的琼脂平板,观察对溶壁微球菌的抑菌效果。置于100、80℃水浴30s、1、3和5min后,观察不同温度处理不同时间后的去杂蛋白效果和对溶壁微球菌的抑菌效果,并对各样品进行电泳分离。结果随加样量增加抑菌环直径增大,10μl环太大易变形,不易测量,以加7μl血淋巴对溶壁微球菌的抑菌效果最佳。平板pH值6.0时,对溶壁微球菌的抑菌环直径最大,随pH值增加而抑菌环直径减小。血淋巴100℃水浴30s、1min仍有抑菌活性,处理3和5min无抑菌活性;80℃水浴30s至5min均有抑菌活性,电泳显示100℃处理3和5min的样品与其他相比缺少2条蛋白区带。结论针刺诱导的丝光绿蝇抗菌肽在酸性条件下抑菌活性更强,分离时血淋巴预处理采用80℃水浴1-3min去杂蛋白效果较好,诱导的血淋巴100℃处理3和5min即丧失抗菌活性,电泳显示缺少2条区带,此2条差异区带可能为抗菌肽组分。

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目前,世界上已记载的昆虫种类超过75万种,估计昆虫的个体数量为1018,昆虫的种类如此之多,个体数量如此之大,引起了人们对其防御机制的关注,很早就有人对昆虫免疫进行研究。昆虫免疫的兴起始于20世纪80年代初,首次分离纯化到天蚕抗菌肽,为一种小分子的肽类,具有广谱的抗菌活性。昆虫免疫的特点是在外界物质的诱导下,能迅速产生或增加许多体液免疫因子,如凝集素、溶菌酶、抗菌肽等,其中抗菌肽是昆虫体液免疫中重要的抗菌因子[1]。不同的昆虫经诱导后产生的抗菌肽均不相同,迄今为止,已从多种昆虫体内诱导产生了抗菌肽,它们多数属于全变态类昆虫,研究工作主要集中在鳞翅目昆虫:惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)、家蚕(Bombyxmori)、柞蚕(Antheraeapernyi)[2,3];双翅目昆虫:棕尾别麻蝇(Sarcophagaperegrina)[4]、伏蝇(Phormiaterranovae)[5]、果蝇(Drosophilamelanogaster)[6]、埃及伊蚊(Aedesaegypti)以及鞘翅目、膜翅目昆虫:双叉犀金龟(Allomyrinadichotoma)、意大利蜜蜂(Apismellifera)等。不全变态昆虫诱导产生抗菌物质的报道很少,仅见于红蝽(Pyrrhocorisapterus)[7]、蓝蜻蜓(Aeschnacyanea)[8]、美洲大蠊(Periplanetaamericana)[9]等。目前,昆虫抗菌肽研究已成为世界科学家关注的焦点之一,均处于基础研究阶段。我们课题组已对丝光绿蝇抗菌肽的诱导表达及部分性质进行了研究[10-12]。现对诱导的丝光绿蝇抗菌肽的电泳分离进行初步的研究探讨,结果报道如下。1材料与方法1.1昆虫及饲养供试的丝光绿蝇(Luciliasericata)由本实验室室内连续饲养繁殖。幼虫生长条件:温度26、相对湿度75%,光照采用60W白炽灯每天12h,幼虫饲料各组分比例如下:麦麸600g、鱼粉100g、牛奶粉40g、酵母粉8g、蛋白胨15g、水1500ml。各组分混匀后,分装于饲料罐中,灭菌后置于4冰箱备用[13]。1.2应试菌种溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus),由本实验室提供,使用前将冻存的菌种复苏,接种到固体培养基上,37恒温培养16-18h备用。1.3诱导丝光绿蝇初3龄幼虫用2号昆虫针针刺体壁诱导,每虫1针,处理后置于幼虫饲料罐中饲养,于室内第48小时收集备用。未经针刺诱导处理的丝光绿蝇幼虫(即正常饲养的幼虫)的血淋巴作对照。1.4血淋巴收集丝光绿蝇幼虫用0~4冷水反复冲洗8~10次,再用无菌双蒸水冲洗3次,滤纸吸干虫体表面水分,剪去头部收集血淋巴于1.5ml离心管中,10000r/min(TGL-16G离心机,上海安亭仪器厂)离心10min,取上清液备用,或置于-20冰箱保存。1.5抑菌活力测定抑菌活力测定采用平板滤纸片法,滤纸片6mm。固体培养基配比如下:蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl5g、琼脂20g,加双蒸水至1000ml,调pH值至6.5,每个7.5cm培养皿加入12ml培养基制成平板备用。细菌复苏培养后,取培养至对数期细菌配成6108cells/ml菌液,涂于平板上,将滤纸片加7l血淋巴样品,37培养24h后测量记录抑菌环直径。1.6诱导后的抑菌效果实验丝光绿蝇针刺诱导后,收集第48小时血淋巴,以溶壁微球菌作为抗菌肽诱导表达的指示菌,做平板抑菌实验,每组重复3次,观察记录诱导前后的抑菌效果,测量记录抑菌环直径。未经针刺诱导处理的丝光绿蝇幼虫(即正常饲

参考文献

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