重金属胁迫对罗非鱼血细胞DNA损伤的影响

作者:张来军;李晓梅;陈永敢;陈攀;杭瑜瑜;公维洁; 刊名:海南热带海洋学院学报 上传者:曹自锦

【摘要】为研究重金属对鱼类的毒性效应,将罗非鱼血细胞分别暴露于低、中、高三种不同浓度的四种重金属溶液Cr(Ⅵ)、Pb、Cu、Hg中2h,采用单细胞凝胶电泳实验(彗星电泳)技术检测血细胞的DNA损伤程度,对照组不加任何重金属,检测指标包括尾部DNA含量、尾长、尾矩、Olive尾矩.结果显示,鱼血细胞对四种重金属胁迫均极为敏感,随重金属胁迫浓度的升高,DNA损伤程度增加.因此,罗非鱼可作为评价重金属污染遗传毒性损伤的敏感性生物标记物.

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0引言重金属污染,是指由重金属或其化合物造成的环境污染.随着城市现代化和工业化的加速发展,导致重金属污染物通过河流、排泄口、家庭污水管、大气迁移和沿海倾倒的废物进入海洋.由于重金属具有不易移动、难溶解,以及富集性的特性,很难在环境中降解,进入生物体后也难以被排出,从而造成生物体慢性中毒,以致水体中痕量重金属通过食物链的各个环节对生态系统造成危害并最终危及人类的健康.为了能准确、及时、全面地反映海洋环境质量现状及发展趋势,需要随时进行环境检测[1].近年来,单细胞凝胶电泳(singlecellgeleletrophoresis,SCGE),或彗星电泳(Cometassay)技术常被用于水环境污染遗传毒理学检测[2-4].这一技术最早用于动物细胞DNA损伤检测,具有简便、快速、灵敏等特点,现在已广泛应用于各种真核生物不同类型的细胞试验.外界环境中的理化因素会对细胞DNA造成损伤,进而可能引起基因突变或癌变,所以判断细胞DNA是否损伤是环境监测中重要的一环.在1999年举行的国际基因毒性检验程序专题学术讨论会中,单细胞凝胶电泳(pH>13)被定为确定某物质是否具有基因毒性的最佳方法[5].罗非鱼生长于16~38的水域,为广盐性鱼类,海淡水中均可生存,耐低氧.本研究以罗非鱼为实验材料,采用单细胞凝胶电泳技术,检测四种重金属Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+胁迫对罗非鱼外周血细胞DNA的损伤,为重金属胁迫的血液毒理学以及评价重金属对海洋环境中生物的影响提供参考资料.1材料与方法1.1主要试剂与仪器正常熔点琼脂糖(NMA,西班牙),低熔点琼脂糖(LMA),TritonX-100,肌氨酸钠,DMSO,上述试剂均为Amresco分装产品.重铬酸钾、硫酸铜、醋酸铅和氯化汞均为国产分析纯.倒置荧光显微镜(德国Leica公司DMI3000),电泳仪(TanonEPS300),电泳槽(北京六一,DYCP-33A).1.2实验动物罗非鱼购自海南省三亚市荔枝沟农贸市场,为海水养殖鱼,体长不超过15cm.试验前用曝气自来水加天然海水,配制成盐度为17~20的实验用水,驯养1周,每天换水1次,试验时挑选健康正常个体进行处理.1.3试验方法用肝素处理的注射器鳃动脉无菌取血,血液用PBS缓冲液稀释到105~106cell/mL,等体积分到不同的离心管中.Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+离子胁迫浓度分别按《渔业水质标准》(GB11607)最高限量值的100倍、500倍和1000倍设置成低浓度组、中浓度组和高浓度组三个胁迫浓度组,具体胁迫浓度如表1至表4中所示.空白对照组不加任何重金属离子,25胁迫2h.胁迫结束后,血细胞以1000r/m离心收集,再用PBS缓冲液冲洗1次,离心,重新加入PBS,调整细胞密度,观察细胞活力,准备电泳.1.4单细胞凝胶电泳按Zhang[6]等改良方法进行单细胞凝胶电泳.将洁净的载玻片在0.6%的常熔点琼脂糖中浸没后取出,置37烘箱烘烤过夜以备电泳;将血细胞悬液和1%低熔点琼脂糖等体积混合均匀,铺在预处理后的载玻片上,4固化5min,将载玻片放入新鲜配制的裂解液(2.5molL-1NaCl,0.1molL-1EDTA,0.01molL-1Tris,1%肌氨酸钠,pH10,1%TritonX-100,10%DMSO)中,裂解1h;蒸馏水冲洗后,再放入电泳缓冲液(0.3molL-1NaOH,1mmolL-1EDTA,pH>13)中,变性解旋20min;电泳20min(26V,300mA);400mmolL-1Tris缓冲液(pH7.5)中和3次;从裂解

参考文献

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