电针预处理对脑缺血再灌注大鼠皮质神经元TRPC6表达的影响

作者:墙建军;王林华; 刊名:湖北中医药大学学报 上传者:王向龙

【摘要】目的 观察电针预处理对脑缺血再灌注大鼠皮质神经元TRPC6表达的影响,探讨其对神经元可能的保护机制.方法 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组和电针预处理组,每组8只.采用大脑中动脉栓塞法制备脑缺血再灌注模型.电针预处理组在造模前取“百会”和“大椎”穴给予电针刺激.造模后24h进行神经功能评分并急性分离大鼠皮质神经元,通过蛋白免疫印迹(western blot)检测神经元TRPC6和Caspase-3蛋白表达,钙影像检测细胞内相对钙离子浓度.结果 与假手术组比较,模型组大鼠的神经功能评分明显增高(P<0.05),大脑皮质神经细胞TRPC6和Caspase-3蛋白表达明显增高(P<0.05),神经元内钙离子浓度升高(P<0.01);与模型组比较,电针预处理组能明显改善脑缺血再灌注后大鼠的神经功能症状(P<0.05),抑制大脑皮质神经细胞TRPC6和Caspase-3蛋白表达(P<0.05),并降低细胞内钙离子浓度(P<0.01).结论 电针预处理对脑缺血再灌注大鼠脑损伤有保护作用,其机制可能与TRPC6下调,减少细胞钙离子内流从而抑制神经凋亡.

全文阅读

脑缺血疾病因其发病率高,致死率高等特点[1],目前临床上缺乏治疗该病的有效手段。近年来,针灸治疗脑缺血的研究层出不穷[2],其中预处理是重要的预防措施之一,在脑缺血前给予电针刺激,诱导脑缺血耐受,从而对脑缺血神经元起到保护作用[3],这种方式对缺血性脑血管疾病高危人群预防性治疗具有重要意义。如何早期预防和有效治疗该病成为研究者们关注的重点,脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,早期主要是脑组织缺血损伤,后期的再灌注损伤主要是由于钙离子超载造成的[4]。神经元中表达丰富的TRPC家族蛋白,以TRPC6最常见[5]。因此,在对脑缺血在管制病理机制深入探讨的过程中,越来越多的研究关注钙离子在缺血性脑血管疾病中的核心地位。研究显示:瞬时受体电位通道蛋白6(transientreceptorpotential6,TRPC6)在大鼠皮质神经元中丰富表达,直接影响神经元凋亡[6]。本研究观察电针预处理对脑缺血再灌注大鼠皮质神经元TRPC6表达的影响,探讨其对神经元可能的保护机制,为临床研究提供参考。1材料与方法1.1动物SPF级健康雄性SD大鼠30只,体重(22030)g(由湖北省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(鄂)2008-0005),所有动物进行适应性饲养1周后开始实验。1.2分组与处理将30只大鼠随机分为3组:假手术组、MCAO模型组和电针预处理组,每组10只。假手术组:只暴露双侧颈总动脉并置线不夹闭。MCAO模型组:动物用10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉。仰卧位固定,颈正中线切口,沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜,分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA),在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA,然后近心端结扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4mm处剪一小口,将拴线插入到ICA,这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。用眼科镊轻推拴线,直到遇到轻微阻力停止插线,紧紧系牢CCA远心端的细线。缝合伤口,单笼饲养观察。如果需要再灌的话,就把拴线抽出即可。电针预处理组:在造模前首先进行电针预处理。取百会、水沟(取穴点位置参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》),采用华佗牌0.20mm25mm针灸针刺入穴位,连接HANS-100电针仪,频率2/15Hz,电流1mA,每次30min,每日1次,连续7天。1.3神经功能评分大鼠神经损伤严重缺损评分(NeurologicalSeverityScores,NSS):0分:神经功能正常;1分:轻度神经功能缺损(提尾时左前肢屈曲);2分:中度神经功能缺损(行走时向左侧转圈);3分:中度神经功能缺损(向左侧倾斜);4分:无自发行走,意识减退;5分:与缺血有关的死亡。1.4神经元TRPC6和Caspase-3测定分离纯化的大脑皮质神经元,并将细胞数调至106/mL。提取细胞总蛋白,并根据BCA蛋白定量试剂盒对所提取的蛋白进行定量。按照每孔30L的体积上样,电泳(90V,100min)、转膜(95V,75min);5%脱脂牛奶封闭PVDF膜30min;在4条件下孵育一抗(单克隆兔抗TRPC6/Caspase-3,11000)过夜;洗膜并在室温下孵育二抗2h(抗兔IgG,11000),洗膜并ECL显影拍照。1.5神经元钙离子测定将各组分离的神经元种于多聚赖氨酸包被的3cm的圆玻片上,并在室温下用100molFuro-2孵育细胞30min,PBS冲洗3遍,上机检测340/380nm比值,即代表细胞内相对钙离子浓度。1.6统计学方法所有数据采用SPSS16.

参考文献

引证文献

问答

我要提问