斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因的时序性表达

作者:刘妮娅;韩东笑;崔浩亮;李瑞;林林;黄陈平; 刊名:解剖学报 上传者:王瓛

【摘要】目的 探讨斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及Dicer基因时序性表达规律.方法 取正常发育至受精后4、8、12、16、20、24、36、48和72 h(hpf)斑马鱼胚胎各约40枚,用Trizol法分别提取总RNA,茎环法反转录为cDNA,用Real-time PCR检测胚胎miR-9、miR-219及Dicer表达量.结果 miR-9、miR-219及Dicer表达水平在胚胎发育过程中呈现峰谷变化,不同发育阶段之间总的差异有统计学意义(P< 0.05).与胚胎发育全程的基因平均表达水平相比,miR-9在8 hpf之前表达量较低(P<0.05),36 hpf后表达量持续增高,48 hpf和72 hpf时表达量显著高于平均水平(P<0.01).miR-219在8 hpf之前表达量也处于较低水平(P<0.05),20 hpf后迅速增高,24hpf时达到峰值,并持续到48 hpf(P <0.01).Dicer在胚胎早期(4 hpf)就有明显表达(P<0.05),随后表达水平迅速下降,16 hpf时达到低点(P<0.05),然后逐渐回升,直至胚胎末期.结论 斑马鱼胚胎发育过程miR-9、miR-219及Dicer时序性表达有一定规律,miR-9主要在胚胎后期表达,miR-219主要在胚胎中期表达,Dicer主要在胚胎早期表达,其次在胚胎后期,提示miR-9、miR-219及Dicer参与胚胎发育调控过程.

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在胚胎发育过程中调控基因时序性表达是胚胎正常发育所必需的。研究显示,MicroRNAs(miRNAs)在调控细胞增殖、分化等活动及维持细胞功能稳定等方面有着重要的作用[1]。在胚胎神经组织特异表达并且表达较早而明显的miRNAs有miR-9、miR-219等,但其在胚胎发育过程中时序性表达规律还有待深入研究[2]。本实验用Real-timePCR检测斑马鱼胚胎发育过程中miR-9、miR-219及其miRNAs成熟酶Dicer基因表达水平,以探讨其在胚胎发育过程中的作用。材料和方法1.实验动物野生型AB品系斑马鱼由温州医科大学斑马鱼实验室提供,斑马鱼养殖按有关规范进行。在饲养系统关灯前将健康性成熟斑马鱼按雄雌12比例置于孵化器内,次晨给光后开始产卵、受精,收集并选取发育正常及发育阶段一致的受精卵,放入含胚胎培养液平皿中置于气候箱内孵养,保持温度(281)、昼夜周期14h10h。2.实验药品及仪器TRIzol试剂(Invitrogen公司),miR-9、miR-219茎环标记引物(广州锐博生物技术有限公司),反转录试剂盒及Real-timePCR试剂盒(Bio-Rad公司),Real-timePCR仪(CFX96,Bio-Rad公司),凝胶成像分析系统(GelDocXR,Bio-Rad公司)。3.实验方法3.1总RNA提取及cDNA合成:分别在斑马鱼胚胎发育至受精后4、8、10、16、20、24、36、48及72h(hourspostfertilization,hpf)收集胚卵,每次每样本收集胚卵约40枚,用TRIzol法提取总RNA。鉴定合格的总RNA,反转录合成cDNA。特定mRNA茎环标记引物是根据斑马鱼dre-miR-9-5p(UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA)和dre-miR-219(UGAUUGUCCAAACGCAAUUCUU)的结构特征,由公司设计合成。合成的cDNA4备用,-20保存。3.2Real-timePCR检测miR-9、miR-219及Dicer表达量:斑马鱼miR-9、miR-219Real-timePCR引物(包括靶miRNA及茎环序列信息)由公司设计合成。根据斑马鱼Dicer(GeneID:324724)的cDNA序列设计荧光定量PCR引物,上游:TCTCCGCTAATGTCCC,下游:GGTTGGTTGGCTTTGA,产物183bp;以斑马鱼-actin(GeneID:57934)作为内参,上游:ACCCACACCGTGCCCATCTA,下游:CGGACAATTTCTCTTTCGGCTG,产物127bp。按照Real-timePCR试剂盒操作步骤,对发育至4、8、10、16、20、24、36、48及72hpf的斑马鱼胚胎miR-9、miR-219及Dicer的mRNA表达量进行检测。同一标本由同时段约40个斑马鱼胚胎构成,重复采样3次。检测时每个标本测3个平行样品,计算3个平行样品的Ct均值,以同一标本-actinCt值作为内参,以24hpf胚胎各基因mRNA表达量为基准,采用2-Ct法计算胚胎其他发育时点该基因mRNA相对表达量。3.3统计学分析:用SPSS13.0统计学软件进行数据分析,多组间均数比较用完全随机设计资料方差分析,多个样本均数两两比较用最小显著差(LSD)法检验,偏态分布资料用数据变换处理后再进行统计分析,方差不齐时用近似检验方法。结果和讨论1.斑马鱼胚胎不同发育阶段miR-9、miR-219表达水平斑马鱼胚胎发育全程约72h,历经卵裂期(0.75~2.25hpf)、囊胚期(2.25

参考文献

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