体外操作对人卵母细胞线粒体膜电位影响的研究

作者:毕星宇;张栋栋;朱鹏飞;苏丹;武学清; 刊名:中华生殖与避孕杂志 上传者:阚亚楠

【摘要】目的 比较体外不同操作对人卵母细胞线粒体膜电位的影响.方法 利用JC-1试剂盒检测人卵母细胞在体外成熟培养、玻璃化冷冻解冻、卵胞质内单精子注射(ICSI)前后的线粒体膜电位变化,从而得出体外不同操作对线粒体膜电位的影响及卵母细胞质量与线粒体膜电位的关系.结果 卵母细胞在体外正常培养成熟、成熟卵母细胞玻璃化冷冻解冻及卵母细胞显微操作过程中线粒体膜电位均无统计学变化(P>0.05).体外成熟培养失败及单精子注射后受精失败的卵母细胞线粒体膜电位有明显下降(P<0.05).结论 体外常规操作对卵母细胞线粒体膜电位并无显著影响,但是线粒体膜电位与卵母细胞质量有密切关系,可以作为检验卵母细胞质量的一个重要指标.

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在生殖中心经常会对卵母细胞进行不同的操作,而这些操作对于卵母细胞质量是否会有影响,不同研究者从不同的角度对此做了很多研究[1-2]。近年来研究表明[3-4],线粒体膜电位与细胞凋亡有着密切的关系,而其中线粒体跨膜电位的改变更是认为直接参与了调控细胞凋亡的发生发展。体外操作是否会影响线粒体膜电位从而引起卵母细胞凋亡呢?我们用线粒体膜电位特异染料(JC-1)染色[5],在线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体(monomer),可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。本研究我们从线粒体膜电位变化的角度分析体外不同操作对卵母细胞质量的影响。通过分析不同操作下卵母细胞线粒体膜电位的变化,研究卵母细胞凋亡的规律,从而可以尽量避免在体外对卵母细胞的损伤。而且检测卵母细胞线粒体膜电位也可以作为评判卵母细胞质量的一个重要标准。1材料与方法1.1卵母细胞收集收集2015年10月2016年10月期间本中心接受辅助生殖技术(ART)治疗周期患者的卵母细胞。选择患者年龄30~35岁,获卵数>20个且是第一周期取卵。取卵当日的未成熟卵及患者自愿放弃的卵经患者签署知情同意书后用于本实验。本研究经医院伦理委员会批准。1.2线粒体膜电位检测方法使用JC-1试剂盒C2005(中国Beyotime)检测线粒体膜电位。按JC-1试剂盒使用说明书要求操作,配置JC-1工作液及JC-1缓冲液(使用前稀释至1),卵母细胞置于JC-1中,37染色20min,然后在JC-1缓冲液中反复吹吸并放置5min,重复洗涤2次后置于荧光显微镜下观察,分别采集红色荧光(激发波长525nm,发射波长590nm)和绿色荧光(激发波长490nm,发射波长530nm)下的图像。最后用ImageJ图像分析软件测量红色荧光及绿色荧光强度的比值,即得出线粒体膜电位。每次实验重复3次。1.3卵母细胞成熟培养取卵手术后,卵冠丘复合体用透明质酸酶(瑞士Vitrolife公司)消化30s,然后用口径135m剥卵针去除卵丘细胞。未成熟卵母细胞置于受精液G-IVF(瑞士Vitrolife公司)中37培养24h。1.4卵母细胞玻璃化冷冻及解冻卵母细胞冷冻解冻按照玻璃化冷冻试剂盒(日本Kitazato公司)说明书操作。冷冻:先将卵母细胞转入平衡液(ES)中观察,卵子脱水再平衡后转入冷冻液(VS),反复吹吸1min内装到载杆上浸入液氮。解冻:先在1号液中将卵母细胞摇下放置1min,然后依次转入2、3、4号液,各放置3min。冷冻及解冻所用各种试剂均来自试剂盒。1.5卵胞质内单精子注射(ICSI)人卵母细胞去除颗粒细胞置入操作液中,制备好精子加入PVP中。首先用显微操作注射针(美国Cook公司)将精子制动,吸入注射针,然后调整卵母细胞位置,将极体调整到12点钟位置,用固定针(美国Cook公司)将卵母细胞固定。注射针从3点钟方向进针,回吸破膜,最后将精子注射入卵母细胞。1.6统计学方法数据采用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料以均数标准差(x-s)表示,组间差异用t检验和方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。2.1卵母细胞体外成熟培养对线粒体膜电位的影响MI期卵母细胞与培养24h成熟的MII期卵母细胞相比,线粒体膜电位(即红色荧光与绿色荧光强度比值)无统计学差异(P=0.368)。但是经过24h仍未成熟的卵母细胞,线粒体膜电位与

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