Ibrutinib抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞生存的作用研究

作者:吴东维;夏冰;吴凌;许雯;宁乔杨;袁田;王超雨;晋鑫;于泳;张翼鷟; 刊名:中国肿瘤临床 上传者:吕波

【摘要】目的:探讨Bruton酪氨酸激酶(Bruton"s tyrosine kinase,BTK)抑制剂ibrutinib抑制弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)细胞生存的作用及其相关机制.方法:用不同浓度的ibrutinib处理DLBCL细胞系SUDHL-10、HBL-1和患者原代细胞,以MTT法检测细胞的增殖抑制情况;以Annexin V/PI流式细胞术和DAPI染色法检测细胞的凋亡情况;应用Western blot法检测细胞表达磷酸化BTK、AKT、ERK的变化.DLBCL细胞与MSC共培养后,体外克隆形成实验和NOD/SCID肿瘤模型小鼠检测ibrutinib在肿瘤微环境里对DLBCL细胞的抑制作用.结果:2.5 μmol/L及更高浓度的ibrutinib对DLBCL细胞的增殖有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性.1.0、2.5 μmol/L ibrutinib作用于SUDHL-10细胞24 h,细胞凋亡率分别为(21.73±3.64)%和(34.71±2.36)%,高于对照组(3.55±1.89)%(P<0.05).5、10 μmol/L ibrutinib处理24 h后,DLBCL细胞系均出现核皱缩(5 μmol/L)、碎裂(10 μmol/L).ibrutinib处理细胞后磷酸化BTK、AKT、ERK的表达均明显降低.ibrutinib抑制共培养时DLBCL细胞的体外克隆形成(P<0.01)及DLBCL细胞在体内的增殖生长,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论:ibrutinib可抑制细胞系SUDHL-10和HBL-1的增殖,诱导凋亡,其机制可能通过阻断AKT、ERK信号途径而实现;在肿瘤微环境中ibrutinib同样对DLBCL细胞具有较强的抑制生存的作用,该药物有望为DLBCL的治疗带来希望.

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弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllympho-ma,DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤中最常见的一种病理类型[1]。近年来很多新药的出现使该病的生存期明显延长,但DLBCL目前仍然是不可治愈的一类疾病[2]。因此,深入探索DLBCL更有效的治疗药物是目前淋巴瘤研究领域的重要课题。近年来,针对B细胞受体(B-cellreceptor,BCR)信号通路重要靶点Bruton酪氨酸激酶(Bruton'styrosinekinase,BTK)的靶向抑制剂ibrutinib因其较好的疗效已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用于慢性淋巴细胞白血病的一线治疗和套细胞淋巴瘤的二线治疗中[3-4];同时,ibrutinib治疗复发/难治性DLBCL的多个临床试验也在进行中,初步结果令人鼓舞[5]。但该药对DLBCL的作用机制研究的报道目前尚少。本研究旨在探讨ibrutinib抑制DLBCL细胞的生存并抑制骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)介导的DLBCL细胞增殖的作用。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞系、患者标本DLBCL细胞系SUDHL-10(GCB亚型)和HBL-1(ABC亚型)由Dr.JianguoTao(美国Moffitt癌症中心血液病理科)提供。细胞接种于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基(ThermoFisherScientific,美国)中,置于37、体积分数为5%的CO2培养箱中,饱和湿度下培养,取对数生长期的细胞用于实验。患者骨髓穿刺液和淋巴组织均取自天津医科大学肿瘤医院血液科8例原发DLBCL患者,其中ABC亚型6例,GCB亚型2例。本研究已获医院伦理委员会批准及供者的知情同意。收集患者骨髓穿刺液和淋巴组织后,以Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单核细胞,再通过CD19标记的磁珠分选法(MiltenyiBiotec,德国)分选淋巴细胞群备用。1.1.2主要试剂ibrutinib购自美国Selleck公司;MTT试剂盒购自美国Sigma公司;AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购自美国BD公司;DAPI核酸染色试剂盒购自美国Intitrogen公司;兔抗人BTK、p-BTK(Tyr223)、AKT、p-AKT(Ser473/Thr308)、ERK1/2、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)单克隆抗体购自美国CellSignalingTechnology公司。1.2方法1.2.1MTT法检测淋巴瘤细胞增殖的抑制率调整SUDHL-10、HBL-1细胞和DLBCL患者原代细胞浓度为4104/mL,接种于96孔板中培养6h。分组如下:对照组(不加ibrutinib)、调零组(仅含有等量RPMI1640培养液)、试验组(ibrutinib药物终浓度分别为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0moL/L),各组设6个复孔,于培养箱中分别培养24、48、72h。于预定时间取出培养板,每孔加入MTT溶液,继续培养4h,弃培养液后加入DMSO,选择570nm波长测定各孔吸光度A值计算细胞活力,细胞活力=(试验组OD-调零组OD)/(对照组OD-调零组OD)100%。试验重复3次。1.2.2流式细胞术和DAPI核酸染色法检测淋巴瘤细胞的凋亡情况取对数生长期SUDHL-10、HBL-1细胞和DLBCL患者原代细胞加入ibrutinib溶液,使药物终浓度分别为1、2.5mol/L,于培养箱中分别培养24h。收集各组细胞行AnnexinV-PI

参考文献

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