细胞转染中单克隆与混克隆干扰基因效率的比较

作者:刘燕;朱吉海;孙伟;赵珺; 刊名:青海医学院学报 上传者:周卫敏

【摘要】目的 比较细胞转染中单克隆与混克隆干扰基因效率.方法 采用胃泌素特异干扰载体转染人胃癌原代细胞株L25,经G418抗性筛选获得混克隆和单克隆细胞,应用RT-PCR、Western blot和免疫荧光三种方法对混克隆细胞和单克隆细胞干扰胃泌素基因的效率进行比较.结果 RT-PCR结果显示混克隆细胞胃泌素mRNA表达水平被明显抑制.在挑取的10株单克隆细胞中,胃泌素的表达均受到干扰,其效果有差异,其中有2株单克隆细胞pshRNA-1、pshRNA-10胃泌素mRNA表达水平抑制率达到86%,抑制效率与混克隆细胞相同,其他8株单克隆细胞的平均抑制率为31%.Western blot和免疫荧光结果均显示单克隆细胞pshRNA-1、pshRNA-10与混克隆细胞在胃泌素蛋白水平的干扰效果相同.结论 采用混克隆细胞进行生物学特性鉴定和后续基因表达水平研究,实验信息量大、周期短、污染几率小、可重复性强,是一种省时、简便、高效的方法.

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分子克隆实验中,经常需要把外源性的DNA通过载体导入细胞,以便进行基因功能、基因调控等方面的实验[1-3]。这些研究要求外源基因能够稳定整合到宿主染色体的细胞中,即我们所说的克隆化细胞[4-5]。以往常用的方法是选择性标记,将携带外源基因的载体加上neo抗性基因,用含G418的选择培养基筛选出有效表达外源基因的单克隆细胞[6-8]。但这种方法由于实验周期过长、不可控因素过多,往往鉴定不出有效的单克隆。本研究以干扰胃癌原代细胞株L25中胃泌素基因的表达为例,构建了带有neo抗性的胃泌素干扰载体(pshRNA-gast),将其转染入L25细胞中,经G418抗性筛选建立稳定整合外源基因的混克隆细胞株和单克隆细胞株,应用RT-PCR、Westernblot和免疫荧光法比较干扰胃泌素表达的单克隆与混克隆细胞中靶基因表达水平的差异,以明确是否有必要通过获得单克隆细胞进行后续研究。1材料与方法1.1材料胃泌素干扰质粒pshRNA-gast及人胃癌原代细胞株由实验室自己构建;细胞培养用DMEM培养基、胎牛血清及胰酶购自美国Gibco公司;Trizol及LipofectamineTM2000试剂购自美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒及PCR10Mix试剂购自北京Trans-gen公司;Gastrin抗体购自英国Abcam公司;二抗购自美国Santacruz公司。1.2方法1.2.1细胞培养将细胞培养于含5%胎牛血清的DMEM培养液中(37,5%CO2)。用0.25%胰酶消化和传代。细胞常规培养至40%~60%汇合时转染。1.2.2细胞转染和筛选1.2.2.1细胞转染混合待转染的质粒和脂质体稀释液,吹打混匀,室温静置20min。把混合液逐滴加入待转染的细胞培养皿中,边加边晃动培养皿,使转染液均匀分布于培养皿。转染细胞继续培养24h,除去双无培养液,换正常培养液培养。其后传代到3~4个100mm细胞培养皿中培养24h。1.2.2.2混克隆筛选细胞转染48h后,用0.25%胰酶消化,传代至60mm培养皿,使每个视野细胞密度在10个左右,加入含G418(400g/mL)的选择性培养液进行筛选,每日观察细胞形态,3~5d换液,22d左右混克隆形成。经RT-PCR法鉴定混克隆细胞中胃泌素的干扰效果。1.2.2.3分离单克隆细胞用环套法从混克隆细胞培养皿中挑取10个单克隆细胞,接种至96孔板,用含G418(400g/mL)的培养液继续筛选培养,待细胞长满96孔板后,传至24孔板继续扩大培养,4w后得到足量的细胞。1.3RT-PCR鉴定胃泌素mRNA水平的干扰效果分别收集混克隆细胞和单克隆细胞,提取细胞的RNA,用RT-PCR法检测细胞胃泌素mRNA的表达水平。具体方法如下:用Trizol试剂提取细胞总RNA,取4gRNA,用随机引物逆转录合成第一链cDNA。以1LcDNA为模板,以25L反应体系进行常规PCR扩增。所用引物:Gastrin上游,5'GACGAGATGCAGCGACTATGT3';下游,5'GGGTCTGCCACGAGGTGT3',扩增片段221bp。-actin上游,5'CGGGAAATCGTGCGTGACATT3',下游:5'CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC3',扩增片段510bp。反应条件:95下5min1个循环;95下持续30s,62下持续30s,72下持续30s,72下持续600s,32个循环。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后用凝胶成像仪照相分析。1.4蛋白表达水平鉴定结果1.4.1Westernblot检测胃泌素的蛋白表达水平收集单

参考文献

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