一氧化氮对热性惊厥大鼠γ-氨基丁酸B受体亚基表达的影响

作者:韩颖;秦炯;卜定方;杨志仙;常杏芝;杜军保 刊名:实用儿科临床杂志 上传者:马丽萍

【摘要】目的探讨一氧化氮(NO)对热性惊厥大鼠γ-氨基丁酸B受体(GABABR)亚基表达的影响。方法大鼠随机分为对照组,热性惊厥(FS)组,FS+硝普钠(SNP)组,FS+NG-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)组。采用热水浴诱导大鼠FS,隔日诱导1次,共10次。采用分光光度计法测定大鼠血浆NO含量;原位杂交方法观察GABABR亚基mRNA和c-fos基因表达情况;采用免疫组织化学方法观察GABABR亚基和Fos蛋白表达情况。结果与FS组比较,FS+SNP组血浆NO含量明显升高,而FS+L-NMMA组血浆NO含量明显降低;FS+L-NMMA组GABABR1和GABABR2表达均高于FS组;FS+SNP组GABABR2表达低于FS组,而GABABR1表达与FS组比较无明显改变;SNP的干预使c-fos基因和Fos蛋白表达增强,而L-NMMA的干预使其表达降低。结论NO可通过调节GABABR的功能,在反复FS中发挥作用。

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近来研究表明,一氧化氮(nitricoxide,NO)在神经系统多种生理和病理生理过程中发挥重要作用[1,2]。我们前期的研究也表明,NO在反复热性惊厥(febrileseizure,FS)脑损伤的形成过程中具有重要调节作用[3]。但NO在反复FS过程中发挥作用的机制尚不清楚。因此,我们利用FS动物模型,通过观察NO在FS过程中对-氨基丁酸B受体(-aminobu-tyricacidBreceptor,GABABR)亚基的作用,探讨NO在FS脑损伤中可能的作用环节及机制。材料与方法一、反复FS动物模型建立和实验分组SD大鼠(北京大学医学部实验动物中心提供)32只(雌性15只,雄性17只),日龄21d,体质量50~80g,随机分为对照组(37.0水浴),FS组(45.2水浴),FS+硝普钠(sodiumnitroprusside,SNP)组(45.2水浴),FS+NG-单甲基-L-精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine,L-NMMA)组(45.2水浴),每组8只。采用热水浴诱导大鼠FS,每次诱导时间不超过5min,隔日诱导1次,共诱导10次。每次水浴处理后1h予FS+SNP组大鼠腹腔注射SNP(4mg/kg),予FS+L-NMMA组大鼠腹腔注射L-NMMA(10mg/kg),予对照组及FS组大鼠腹腔注射相同容积的生理盐水,4组大鼠的常规饲养及饮食条件相同。二、标本取材和制备所有大鼠于最后一次水浴处理后2h取材。用10%(w/v)水合氯醛麻醉,经下腔静脉留取大鼠肝素化抗凝血3mL左右,离心后取血浆,置-70冰箱保存以备测NO含量。打开胸腔,经左心室快速灌注生理盐水10~30mL,继而以含4%(w/v)多聚甲醛磷酸缓冲液进行内固定,断头取脑,置上述缓冲液中后固定18~20h。液氮速冻脑标本,冷冻冠状切片,切片厚度10m,用于免疫组织化学和原位杂交。三、血浆NO含量的间接测定NO试剂盒购自邦定泰克公司。取0.1mL双蒸水于空白管中,0.1mL试剂5(硝酸钾标准液)于标准管中,0.1mL血浆于样品管中,加0.1mL试剂1和0.1mL试剂2,混匀后37孵育60min,加0.5mL试剂3和0.5mL试剂4,室温放置10min,应用分光光度计在530nm波长处,以B管调零,测定样品管和标准管吸光值(A)。血浆NO(mol/L)=样品管(A)/标准管(A)100。四、原位杂交及免疫组织化学染色1.原位杂交:试剂盒购自天津灏洋生物制品公司。操作按试剂盒说明书进行。DAB显色,中性树脂封片。阴性对照采用正向RNA探针代替RNA探针。结果判断:棕黄色为阳性反应颜色,显微镜下肉眼观察比较海马区阳性反应的着色程度。在40显微镜下采用双盲半定量评估:每实验组中每个标本随机切取6张切片,每张切片在40显微镜下随机选取6个视野,按每个视野阳性细胞数百分比进行计算,每组鼠中所有切片所有视野的百分比的平均值粗略计为该组阳性表达值。每组鼠阳性细胞数定评估标准为:0,(-);<25%,(+);25%~50%,(++);50%~75%,(+++);75%~100%,(++++)[4]。2.免疫组织化学:试剂盒购自天津灏洋生物制品公司。操作按试剂盒说明书进行。GABABR1-抗(豚鼠抗大鼠)为Oncogene生物公司产品,GABABR2-抗(兔抗大鼠)为SantaCruz生物公司产品,Fos-抗(兔抗大鼠)为SantaCruz生物公司产品。山羊抗豚鼠二抗为SantaCruz生物公司产品,山羊抗兔二抗为Sigma生物公司产品。阴性对照采用PBS代替一抗。封片后用光学显微镜进行

参考文献

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