过氧化氢诱导视网膜色素上皮细胞氧化损伤模型的建立

作者:杨影;曲超; 刊名:实用医院临床杂志 上传者:白利军

【摘要】目的探讨视网膜色素上皮细胞氧化损伤模型的构建方法。方法将培养的人视网膜色素上皮细胞分为对照组和实验组,实验组加入50、100、200、300、400μmol/LH_2O_2,对照组不加入H_2O_2,采用MTT法检测细胞活力,在培养箱内分别培养2、8、24 h,采用CCK-8检测细胞抑制率,用比色法观察每组中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量的变化,流式细胞术检测细胞凋亡。结果人RPE细胞经200μmol/LH_2O_2处理2、8、24 h后,与对照组比较细胞的活力、抗氧化物酶SOD活性均出现显著降低(P<0.05),MDA含量均有显著升高(P<0.01),细胞凋亡率较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 200μmol/LH_2O_2作用处理人视网膜色素上皮细胞是体外模拟视网膜色素上皮细胞氧化损伤的良好模型。

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年龄相关性黄斑变性(age-relatedmacularde-generation,AMD)又称为老年性黄斑变性(senilemaculardegeneration,SMD),在临床上既是常见病又是难治性疾病,常常引起患者视力下降甚至失明,且发病有逐年增加的趋势。关于AMD的病因尚未完全明了,有研究表明人视网膜色素上皮细胞(RPE)的氧化损伤在年龄相关性黄斑变性的发病和病程发展中起重要的作用,RPE抗氧化损伤的研究将对AMD等视网膜疾病的治疗开阔新的前景。氧化应激是指细胞暴露于活性氧而引起的细胞损伤,过氧化氢(H2O2)是一类活性氧,其极易透过细胞膜与细胞内的铁离子(Fe2+)通过Fenton反应产生很高活性的羟自由基(OH),攻击细胞结构从而引起细胞损伤[1],但这种损伤不会造成细胞死亡,而且在适宜的保护剂作用下,这些损伤还有可能被修复[2]。由于H2O2易于获得,性质相对稳定,所以其已成为研究细胞氧化损伤的重要工具。因此,本研究2015年1月至2016年5月以RPE细胞为研究对象,以H2O2为氧化损伤诱导剂,建立一种可靠的体外模拟氧自由基诱导细胞氧化损伤模型,旨在为后续研究氧化损伤的机制以及抗氧化应激药物的筛选提供试验基础。1材料与方法1.1材料与仪器人视网膜色素上皮细胞D407细胞系由四川省人民医院分子遗传中心实验室提供,H2O2溶液(购自美国SigmaAldrich公司),RPMI-1640培养基、胎牛血清(购自美国GIBCO公司),MTT试剂盒、CCK-8试剂盒(购自美国Sigma公司),总超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(购自中国LEAGENE公司,)丙二醛(MDA)测试盒(购自南京建成生物技术有限公司),流式细胞检测仪(美国BectonDicknson),AnnexinV-FITC流式凋亡试剂盒(美国BD公司),超净工作台(购自苏州净化设备有限公司),细胞培养箱(购自美国Shellab公司)。1.2试验方法1.2.1细胞复苏与培养遵守快融的原则,先将水浴锅调至37~37.5,从-80冰箱或者液氮罐里拿出人视网膜色素上皮细胞冻存管迅速投入37温水中,并轻轻摇动使其内容物迅速融化(最好在1min以内),取出冻存管,微微上下晃动冻存管,用75%酒精消毒后开启,用吸管吸出溶解后的细胞悬液,注入离心管并加入5ml的含10%胎牛血清(FBS)的细胞培养液。以800~1000rpm离心5min,除去上清液,加入1ml培养液吹打,使其形成悬浮液。用含20%FBS的细胞培养液适当稀释后,调整细胞浓度为50106/ml接种到25cm2培养瓶,置于37、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养,每2d换液1次,细胞近铺满(80%~90%)时,用2.5g/L胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的人RPE传代细胞接种于6孔板及96孔板中。1.2.2H2O2浓度的筛选将细胞按浓度1106/ml接种于96孔板中,37培养24h后分别加入0、50、100、200、300、400mol/L(n=6)H2O2,于培养箱内孵育24h,每孔加入20L5mg/mlMTT,将培养板在培养箱内孵育4~6小时,吸去培养液,每孔加入150l二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值(A490)。细胞抑制率(%)=[A(对照组)-A(实验组)]/A(对照组)100%,筛选出合适的H2O2浓度。1.2.3CCK-8检测细胞抑制率收集生长良好的人RPE细胞,调整细胞浓度至1106/ml,分别接种于96孔板中培养24h,同步化后分成正常对照

参考文献

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