基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析技术在微生物检测与鉴定中的应用

作者:杜美红;赵瑞雪;李静雯; 刊名:食品安全质量检测学报 上传者:许建伟

【摘要】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)在微生物检测与鉴定中有着广泛的应用前景。本文着重介绍了MALDI-TOF MS分析技术微生物检测原理、前处理技术及其在微生物检测、鉴定、分型、溯源分析中的应用。与传统的检测鉴定方法相比,MALDI-TOF MS分析技术表现出成本低、检测时间短、易于操作等显著的技术优势。随着微生物质谱数据库以及分析方法的逐渐完善,该技术将成为微生物实验室致病菌快速检测鉴定的重要分析手段。

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1引言 由微生物致病菌引起的食品安全事故是全世界共性问题。检测与鉴定食品中的微生物使得污染的致病菌得到溯源,能够提供有效的信息,及时控制与阻止中毒事件的发生与发展。目前,微生物的检测与鉴定主要为传统的培 养方法和生理生化方法,这些方法鉴定方法周期长(3~5d),灵敏度和特异性都较差,很难满足检测与鉴定的需求。近年来,免疫分析技术[1-3]和分子生物学技术[4,5]因具有特异性高、检测速度快的优势而被应用于微生物的检测与鉴定,但这些技术对检测人员自身素质要求高,影响了其在基层实验室的普及与使用。质谱分析技术作为一种新型的检测技术,以其低成本、快速、易操作的优势在微生物的检测鉴定中得到快速发展[6-9]。本文重点阐述了基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)分析技术在微生物检测与鉴定中的应用。 1975年,Anhalt和Fenselau在300~350下高温裂解冻干细菌,通过质谱仪检测产生特征谱峰,采用质谱技术对肠杆菌微生物进行分析鉴定[10],开启了质谱技术鉴定微生物的时代。但是这种方法灵敏度不高,裂解后的混合物质谱图非常复杂,仅能鉴定出细菌为革兰氏阴性细菌,还不能鉴别出阴性菌间的差异。随后,快原子轰击(fastatombombardment,FAB)、共振吸收(plasmadesorption,PD)和激光解析电离(laserdesorptionionization,LDI)等质谱技术的发展,使得质谱分析在微生物鉴定中的应用更加深入,然而这些技术提供的微生物信息还是有限,只能检测小分子的生物标记物及提供较少的结构信息,而且其样品的前处理过程比较复杂[11]。随着MALDI-TOFMS的出现,基于质谱图中存在的微生物特异性分子或离子可分析不同微生物菌体蛋白肽指纹图谱的差异,对微生物种属进行更准确的鉴别,使得质谱分析技术在微生物检测鉴定中得到更好的发展[12-14]。 2MALDI-TOFMS微生物鉴定分析原理 微生物包括细菌、病毒、霉菌和酵母菌等。微生物的主要组成成分为具有生物活性的蛋白质和核酸,从分子生物学的角度看,核酸(基因)决定蛋白的表达,蛋白质的表达决定生物体的表型。因此,基于蛋白质指纹图谱进行的微生物鉴定分析,相比核酸水平进行的鉴定更为准确和直接。 MALDI-TOFMS是通过对蛋白质的解离分析来完成对微生物的鉴定与分型的。用激光照射微生物样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收大部分能量(保护样本),即质子(H+)转移到生物分子上使其带正电荷,生物分子被汽化。带正电荷离子在电场作用下加速通过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,即离子的m/z与离子的飞行时间成正比。这种方式产生的离子用飞行时间(timeofflight,TOF)检测器检测,采集数据并获得图谱,通过软件分析得到鉴定结果,从而对样品进行定性和定量分析[15]。该检测方法采用软电离方式(对样品的破坏最小),可产生稳定的分子离子,因而是测定生物活性大分子物质非常有效的方法。 3MALDI-TOFMS微生物分析技术 3.1前处理 获得稳定的重复性好的微生物特征性MALDI-TOFMS质谱图取决于微生物样品与基质是否形成共结晶,样品和基质的共结晶越均匀,重复性越好,所以基质的选择与样品的制备非常关键。研究表明,与微生物样品结合解吸效果较好的基质为-氰基-4-羟基肉桂酸(-cyano-4-hydroxycin

参考文献

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