反转录病毒介导人骨形态发生蛋白2基因修饰骨髓基质细胞的体内成骨效应

作者:蔡善保;杨民;马庆军;余希杰;党耕町;王申五;马大龙 刊名:中国临床康复 上传者:池仁辉

【摘要】目的:构建人骨形态发生蛋白2反转录病毒表达载体,探讨以转人骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞为种子细胞的组织工程骨修复骨缺损的可行性。方法:实验于2001-05/2003-01在北京大学医学部完成。①采用DNA重组技术,将骨形态发生蛋白2cDNA克隆到pLXSN反转录病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/BMP2重组反转录病毒。取15d龄BALB/c系小鼠5只用于骨髓基质细胞的提取。将重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞,经筛选后,聚合酶链反应鉴定人骨形态发生蛋白2cDNA在转基因骨髓基质细胞中的整合情况。②转基因骨髓基质细胞的骨形态发生蛋白2表达情况采用免疫印渍杂交和核糖核酸印渍杂交技术检测。转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶的表达采用钙-钴法染色检测,用以评定表达骨形态发生蛋白2的生物活性。③取6周龄BALB/c小鼠6只,将转基因骨髓基质细胞与羟基磷灰石构建人工骨植于小鼠骨骼肌内,体内成骨情况予组织学观察评估。结果:①pLXSN/BMP2质粒的鉴定结果:经酶切及DNA测序证实重组pLXSN/BMP2序列正确。②重组病毒的滴度测定结果:包装的病毒滴度为(6~8)×105cfu/mL。③基因整合及表达的分析:聚合酶链反应证实转基因骨髓基质细胞基因组中有骨形态发生蛋白2cDNA整合;核糖核酸印渍杂交和蛋白免疫印渍杂交证实转基因骨髓基质细胞稳定表达人骨形态发生蛋白2;钙-钴法染色证实转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶阳性。④小鼠体内成骨情况:甲苯胺蓝染色的组织切片镜下观察显示转骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞构成人工骨可见少量软骨细胞及软骨基质存在,软骨细胞呈巢状分布。结论:成功地构建了pLXSN-BMP2重组反转录病毒载体,该载体不仅有效地表达骨形态发生蛋白2蛋白,表达的骨形态发生蛋白2能够诱导未分化的骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,且在体内肌肉环境下能促进成骨。

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0引言骨缺损的基因治疗,国外处于起步阶段,国内研究尚少,仍有许多方面需要探索,譬如外源基因与表达载体的选择;如何将基因治疗与组织工程结合,促进种子细胞向成骨细胞方向分化与增殖等。本实验拟利用反转录病毒载体将人骨形态发生蛋白2cDNA导入小鼠骨髓基质细胞,观察体外表达,并用转基因骨髓基质细胞为种子细胞,探讨用基因修饰的组织工程方法来修复骨缺损的可能性。1材料和方法设计:观察性实验。单位:北京大学医学部。材料:实验于2001-05/2003-01在北京大学医学部完成。质粒、菌株和细胞:pSP65/BMP2(由美国GeneticsInstitute的Dr.Wozney教授惠赠),反转录病毒质粒pLXSN,pLXSN/GFP及其包装细胞PT67(clon-tech公司,由北京大学人民医院王申五教授惠赠)。NIHSwiss小鼠成纤维细胞NIH3T3,E.ColiDH5菌株(本室保存)。酶和试剂:各种酶、DNA提取纯化回收试剂盒、反转录-聚合酶链反应试剂盒及主要试剂(均购自Promega,GIBCOBRL和Qiagen公司),胎牛血清(Hyclone公司),聚合酶链反应引物(北京赛百盛公司合成),小鼠抗人骨形态发生蛋白2单克隆抗体(SantanCruz),(-32P)dCTP(亚辉生物技术有限公司)。羟基磷灰石人工骨载体为正方体,约5mm5mm5mm大小,由羟基磷灰石(60%)和磷酸三钙(40%)构成的多孔复合物,孔径300500m,孔隙率70%80%(由清华大学精细陶瓷实验室制作提供)。设计、实施、评估者:实验设计和干预实施为第一作者,第二、四作者参与部分实验,第三、五、六、七作者为本实验的指导和评估者。所有作者均接受过科研培训。方法:重组pLXSN/BMP2质粒的构建及鉴定:用EcoRI将骨形态发生蛋白2cDNA自pSP65/BMP2质粒中切下,连入EcoRI酶切后去磷酸化的pLXSN上。挑取克隆提取质粒DNA,EcoRI酶切鉴定是否含骨形态发生蛋白2插入片断,用HpaI酶切鉴别连接方向,连接方向正确的克隆由北京大学人类疾病基因研究中心进一步测序。重组病毒的包装、筛选及滴度测定:用脂质体介导转基因方法(参见试剂盒说明书)将8g重组pLXSN-BMP2,pLXSN-GFP或pLXSN质粒转染对数生长期60%80%汇合PT67包装细胞,37孵箱中培养。48h后加入终浓度为800mg/L的G418筛选两三周。当细胞集落长到肉眼可见时,挑取克隆扩大培养收集上清,经0.45m微孔滤膜过滤后-80保存。以NIHSwiss小鼠成纤维细胞NIH3T3作为靶细胞,加入病毒上清和终浓度为8mg/L的聚凝胺进行感染,G418(600mg/L)筛选,2周后在显微镜下数集落,计算滴度犤1犦。骨髓基质细胞的骨形态发生蛋白2及绿色荧光蛋白基因转导:取15d龄BALB/c系小鼠5只(北京大学医学部实验动物中心提供,合格证号:SR-97041),无菌条件下冲洗双下肢股骨和胫骨的骨髓腔,直接贴壁法培养骨髓基质细胞,传代培养的第35代细胞用于如下实验犤1犦。取第35代细胞,用相同滴度的pLXSN-BMP2,pLXSN-GFP及pLXSN病毒上清(含聚凝胺8mg/L)感染,2h后补加含100mL/L胎牛血清的新鲜培养基继续培养,48h后换含G418(500mg/L)及100mL/L胎牛血清的培养基,继续培养710d,荧光显微镜连续观察绿色荧光蛋白基因转导细胞情况,并收集细胞检测转基因的整合与表达。骨形态发生蛋白2在转基因骨髓基质细胞的整合状态采用聚合酶链反应检测:提取转骨形态发生蛋白2、转pL

参考文献

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