不同培养体系对猪卵母细胞体外发育潜力的影响

资源类型:pdf 资源大小:649.00KB 文档分类:生物科学 上传者:唐贵

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【作者】 刘珠果  尚书江  阎新龙  叶华虎  吴晓洁  邓继先 

【关键词】 卵母细胞 体外成熟 颗粒细胞 卵母细胞移植 

【出版日期】2005-04-30

【摘要】目的:研究猪卵母细胞体外成熟的最佳条件,为用体细胞核移植的方法生产转基因克隆猪提供大量优质的MⅡ期卵母细胞。方法:采用猪卵母细胞体外成熟技术,研究了不同激素组合、猪卵泡液、半胱氨酸和颗粒细胞对猪卵母细胞体外成熟和发育潜力的影响。结果与结论:以15U/mlPMSG+20U/mlhCG成熟率最高,为(70.0±3.30)%,显著高于15U/mlFSH+30U/mlLH、10U/mlPMSG+10U/mlhCG〔成熟率分别为(45.6±5.10)%,(60.0±3.30)%〕,添加激素能促进卵母细胞的分裂,添加15%的猪卵泡液成熟率最高,为(86.7±3.35)%,显著高于5%,10%和20%组〔成熟率分别为(73.3±3.35)%,(71.2±5.08)%和(70.0±6.70)%〕,添加猪卵泡液促进了激活卵母细胞的分裂,在培养基中添加半胱氨酸和颗粒细胞,实验组和对照组成熟率差异不显著(P>0.05),但孤雌激活后卵裂率显著提高(P<0.05)。

【刊名】军事医学科学院院刊

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卵母细胞的体外成熟(maturationinvitro,IVM)可以为用体细胞核移植的方法生产大型转基因动物的研究提供大量MⅡ期卵母细胞。从20世纪80年代末至今,猪卵母细胞的体外成熟技术发展很快,如NCSU系列培养基的出现[1],大腔卵泡液[2],不同激素组合的添加[3],半胱氨酸[4]和颗粒细胞等的运用。但仍存在一些急待解决的问题,如与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟的卵母细胞生产的体细胞克隆胚胎在体外的发育能力低,囊胚率低,囊胚数目少,产仔率下降,这些都说明了体外成熟的卵母细胞胞质成熟不充分,Sun等[2]认为,猪体外成熟卵母细胞发育力低下的主要原因是胞质成熟不充分。目前判断猪卵母细胞胞质成熟还没有一个统一的标准,有学者认为可以以卵母细胞激活后的发育为判定标准。本研究目的是通过对目前报道的影响猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活后胚胎分裂的几个重要条件进行比较研究,找到适合猪卵母细胞体外成熟的最佳条件,为体细胞核移植技术生产转基因克隆猪提供大量优质的成熟MⅡ期卵母细胞,提高克隆猪的成功率。1材料和方法1.1药品及试剂FBS(胎牛血清)购于Hyclone公司,其他药品均购于Sigma公司。1.2猪卵巢及卵丘卵母细胞复合体(COCs)的收集猪卵巢由北京丰台友谊屠宰场采集,摘取刚屠宰的母猪卵巢,立即放入添加双抗的30~35℃的灭菌生理盐水中,1.5h内送回实验室。卵巢组织用灭菌的生理盐水清洗3次,除尽周围的脂肪和系膜,用灭菌的医用纱布吸干,再用带标准18号针头的无菌注射器(内有少量平衡后的TL HEPES PVA[5])抽取卵巢表面直径为3~6mm的卵泡。在立体显微镜下捡卵。根据卵丘细胞的层数、致密度和卵母细胞胞质的均匀程度将卵丘卵母细胞复合体(COCs)分为4级,其中A级:卵丘在3层或以上,包裹致密,卵母细胞胞质黑色均一;B级:卵丘为1~2层,包裹较为致密,胞质黑色均一;C级:卵丘疏松扩散,胞质较为均一;D级:为裸卵。本实验仅取A类COCs用于成熟培养。1.3颗粒细胞的分离和培养取同一头猪两卵巢,用注射器抽取大小卵泡中的卵子,抽取液放入10ml尖底离心管,沉淀后吸取上清液放入另一离心管,用PBS清洗,低速(300r/min)离心,取上清液再离心(1200r/min)后弃上清液,给沉淀物中直接加入含10%FBS的DMEM,吹打,制成细胞悬液,接种于培养皿以备用。1.4卵母细胞的体外成熟培养捡出的COCs用DPBS洗涤3次,然后用培养液洗涤3次,移入含成熟培养液滴的35mm培养皿中。每个液滴100μl,覆盖石蜡油,每滴放COCs10~20枚。液滴预先在39℃、5%的CO2与饱和湿度条件下平衡2h以上。基础成熟培养液为含10%胎牛血清、0.22mg/L丙酮酸钠、75mg/L青霉素、50mg/L硫酸链霉素的mNCSU23。1.5卵母细胞成熟的判定体外培养44h的卵母细胞,经含0.1%透明质酸酶的PBS消化除去卵丘,10μg/mlHoechst33342染色[6],荧光显微镜观察染色体和极体,MⅡ为成熟卵。1.6成熟卵母细胞的孤雌激活收集体外成熟的具有明显第一极体的卵母细胞用于孤雌激活,上述成熟卵母细胞经0.1%透明质酸酶PBS消化除去卵丘,用含BSA的NCSU23培养液洗涤3次,将其置于含10μmol/L离子霉素(ionomycin)的NCSU23中作用15min,用含牛血清白蛋白(BSA)的NCSU23培养液洗涤3次,再将其置于含5mmol/L6二甲基氨基嘌呤(6DMAP)的NCSU23中作用3.5h,再用含BSA的NCSU23培养液洗涤3次,将其转入含BSA的NCSU23培养液液滴中培养,每个液滴100μl,覆盖石蜡油,每滴放激活胚10~20枚。36h检查胚胎分裂,计算激活率。1.7激活胚胎的培养卵母细胞激活后转入100μl微滴中培养,每个液滴放激活胚10~20枚,培养条件为39℃、5%CO2、饱和湿度,培养基为含BSA的NCSU23。36h检查胚胎分裂,计算激活率。1.8数据分析为了降低季节、卵巢来源和实验批次造成的误差,表1~表3中的数据均在同一季节、相同卵巢来源和实验条件下得到,每次实验重复4次以上。表1和表2的数据用单因素多水平的方差分析进行处理,表3中的数据用2×2的析因设计的方差分析进行处理,检查数据的正态性和方差齐性满足要求后,用SAS软件编程计算。2结果2.1不同浓度的激素组合对猪卵母细胞体外发育潜力的影响(表1)在mNCSU23中添加不同浓度的卵泡刺激素(FSH)+黄体生成素(LH)、孕马血清促性腺激素(PMSG)+人绒毛膜促性腺激素(hCG)激素组合,结果添加15U/mlPMSG+20U/mlhCG成熟率最高,为(70.0±3.30)%,与对照组及其他实验组相比,差异显著(P<0.05)。添加15U/mlFSH+30U/mlLH、10U/mlPMSG+10U/mlhCG组和对照组相比,成熟率和激活率都显著高于对照组(P<0.05),但成熟率低于15U/mlPMSG+20U/mlhCG组。2.2不同浓度的卵泡液对猪卵母细胞体外发育潜力的影响(表2)在含有15U/mlPMSG+20U/mlhCG的mNCSU23中添加卵泡液对猪卵母细胞的发育潜力具有促进作用,实验组卵丘细胞扩散早、成熟率和分裂率高。添加卵泡液的实验组,卵丘细胞大都呈现四级扩散。其中添加15%的卵泡液的实验组,卵母细胞成熟率和孤雌激活后胚胎的分裂率最高,为(86.7±3.35)%和(86.7±3.35)%,与其他各组相比,差异显著(P<0.05)。2.3半胱氨酸、颗粒细胞对猪卵母细胞体外发育潜力的影响(表3)在含有15U/mlPMSG+20U/mlhCG+15%猪卵泡液(PFF)的mNCSU23中单独添加0.57mmol/L的半胱氨酸或颗粒细胞或者同时添加0.57mmol/L半胱氨酸与颗粒细胞,和对照组相比,成熟率没有显著差异。添加0.57mmol/L的半胱氨酸或颗粒细胞和两者同时添加组,激活后分裂率显著提高,高于对照组(P<0.05)。表1不同浓度的激素组合对猪卵母细胞体外发育潜力的影响组别激素组合培养个数44h成熟情况成熟率(%)激活卵数36h分裂情况激活率(%)1对照组(无激素)9013.3±3.351232.8±7.51215U/mlFSH+30U/mlLH9045.6±5.104158.5±1.46315U/mlPMSG+20U/mlhCG9070.0±3.30#6360.4±4.11410U/mlPMSG+10U/mlhCG9060.0±3.305459.3±1.65P<0.05,与对照组比较,#P<0.05,与1,2,4组比较表2不同浓度的卵泡液对猪卵母细胞体外发育潜力的影响组别不同卵泡液浓度培养个数44h成熟情况成熟率(%)激活卵数36h分裂情况激活率(%)1mNCSU239067.8±1.916160.7±4.002mNCSU23+5%PFF9073.3±3.356668.2±3.973mNCSU23+10%PFF9071.2±5.086470.2±3.60#4mNCSU23+15%PFF9086.7±3.357870.5±1.40#5mNCSU23+20%PFF9070.0±6.706366.5±3.20P<0.05,与4组比较,#P<0.05,与1,5组比较表3半胱氨酸、颗粒细胞对猪卵母细胞体外发育潜力的影响组别培养基中添加成分半胱氨酸(0.57mmol/L)颗粒细胞卵母细胞数44h体外成熟情况检查卵数成熟率(%)激活卵数36h分裂情况检查卵数激活率(%)1--909083.3±3.35757570.5±5.552-+909082.2±6.93747483.9±2.803+-909081.1±8.40737380.8±1.424++909085.6±5.10777786.3±4.16P<0.05,与1组比较3讨论哺乳动物的卵母细胞,从动物出生前后到初情期排卵前促性腺激素峰出现之前,一直停留在第一次减数分裂前期的双线期。排卵前促性腺激素作用使卵母细胞减数分裂重新恢复,形态学特征表现为核膜消失,生发泡破裂(germinal vesiclebreakdown,GVBD)[7]。在哺乳动物卵母细胞成熟过程中,促性腺激素起了重要的作用。在猪卵母细胞的体外培养中,不同浓度的激素组合对于猪卵母细胞的成熟十分重要[8]。Mattioli等[9]报道了同时添加FSH和LH能促进猪卵母细胞的体外成熟。在猪卵母细胞的体外培养中多采用10U/mlPMSG+10U/mlhCG的组合。但有研究认为适当增加激素浓度有利于卵母细胞的体外成熟。本研究发现,15U/mlPMSG+20U/mlhCG卵母细胞成熟率最高,显著高于10U/mlPMSG+10U/mlhCG和15U/mlFSH+30U/mlLH组,各组的成熟率(%)分别为70.0±3.30,60.0±3.30和45.6±5.10。该结果表明激素的有效活性单位是猪卵母细胞成熟的关键因素。本实验发现,PMSG和hCG的组合较FSH和LH的组合更能有效地促进猪卵母细胞成熟,这和目前国内外的多数报道一致,可能是由于不同动物的种属差异引起的。Dorrington等[10]研究认为,猪卵母细胞在激素作用下成熟的机制,是因激素的作用增加了芳香酶的活性和孕酮的合成,刺激cAMP的偶联,诱导促卵泡释放激素受体的出现,当促卵泡释放激素与其结合后,启动了卵母细胞的减数分裂成熟。Naito等[11]最早发现,在卵母细胞培养液中添加猪卵泡液能促进猪卵母细胞受精后雄原核的形成。此后发现,猪卵泡液还能促进猪卵母细胞核的成熟[12]和后期的发育能力[13]。但卵泡液的浓度各有差异,较常用的是添加10%和15%的卵泡液。本研究发现在NCSU23培养液中添加15%的卵泡液,卵母细胞的成熟率更高,和其他各组相比差异显著(P<0.05)。激活后胚胎的分裂实验组之间未见明显差异,但添加猪卵泡液和对照组相比能显著促进猪卵母细胞激活后的卵裂,和先前的报道一致[11~13]。猪卵泡液促进卵母细胞体外成熟和后期的发育能力,Yoshida等[12]认为卵泡液中存在的相对分子质量为(10~200)×103的酸性物质可能起了重要的作用。卵母细胞的成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟,胞质成熟对于卵母细胞后期的发育十分重要,它是胚胎发育的物质基础。目前判断胞质成熟还没有一个统一的标准,多数学者认为可以卵母细胞激活后的卵裂和发育作为判定指标。半胱氨酸促进卵母细胞胞质成熟在本实验中得到进一步证实。本研究还发现颗粒细胞对卵母细胞胞质的成熟具有促进作用,它促进了激活后胚胎的分裂。颗粒细胞和半胱氨酸联合运用对卵裂没有协同作用。许多研究已经发现,卵母细胞对半胱氨酸的吸收有2种途径,一是由颗粒细胞通过细胞间连接运送到卵母细胞,二是经卵细胞的XC-系统和ASC系统直接进入卵细胞[14]。Yoshida等[15]报道,在富含半胱氨酸的MB752/1或添加半胱氨酸的M199中培养的猪卵母细胞,GSH胞质浓度显著高于对照组。半胱氨酸的作用机制目前尚不完全清楚,Nagai[16]认为,半胱氨酸通过其合成产物———谷胱甘肽(GSH)发挥作用,GSH能够对抗卵母细胞的氧化损伤,提高卵细胞发育能力。目前还未见颗粒细胞对卵母细胞成熟的报道,本实验发现与颗粒细胞共培养组,卵母细胞成熟率虽然没有显著提高,但成熟卵母细胞的形态和体内成熟的卵母细胞接近,卵周隙比体外成熟卵母细胞小,第一极体完整的比率更高。颗粒细胞促进卵裂的具体机制目前还不太清楚,但可能是由于颗粒细胞在培养过程中,分泌了一些细胞因子,对卵母细胞的胞质成熟有利。感谢军事医学科学院统计学教研室李峰青同志给予统计学指导!不同培养体系对猪卵母细胞体外发育潜力的影响@刘珠果$军事医学科学院生物工程研究所!北京100071 @尚书江$军事医学科学院实验动物中心!北京100071 @阎新龙$军事医学科学院生物工程研究所!北京100071 @叶华虎$军事医学科学院生物工程研究所!北京100071

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