Exenatide对高糖培养的视网膜神经节细胞的保护作用

作者:匡洪宇;刘余;郝明;傅铮;马丽丽 刊名:国际眼科杂志 上传者:李锦青

【摘要】目的:评价Exenatide对视神经保护作用,并初步探索其对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的保护机制。方法:体外培养RGCs,免疫荧光检测RGCs是否表达胰升糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1receptor,GLP-1R),采用高糖作为细胞凋亡诱导剂建立RGCs凋亡模型,并用不同浓度Exenatide加入细胞培养基中进行干预,用CCK-8检测细胞存活率。结果:免疫荧光结果显示,RGCs存在GLP-1R的表达。CCK-8检测结果显示终浓度为0.5~1μg/L时Exenatide均可促进RGCs存活,其中0.5μg/L浓度较低且已有明显保护作用(P<0.05)。结论:Exenatide注射液对高糖引起的RGCs生存抑制有一定保护作用,这种保护作用很可能通过GLP-1R介导的细胞内保护机制产生。

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0引言糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)最常见的微血管并发症之一,是主要的致盲疾病。而近来研究发现,视网膜的神经病变早于微血管病变,且发现保护视网膜神经细胞会延缓DR的发生[1]。视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)是视网膜中分化最早的神经元,也是视网膜中形成视觉的主要细胞,RGCs的进行性死亡是视功能不可逆性损害的主要原因。Exenatide是一种降糖的新药,主要成分exendin-4是合成肽类,具有肠促胰岛素分泌激素类似物效应。现已证实Exenatide是一种GLP-1R激动剂,它可在体内外与GLP-1R结合并激活该受体,进而引起一系列的细胞内的反应。近期大量的研究表明,GLP-1R激动剂对神经细胞存在有效的保护作用[2,3],但尚无Exenatide对RGCs的保护作用的研究。本实验是为了研究Exenatide是否对视神经也有相似的保护作用,为临床提供DR预防和治疗的新思路。1材料和方法1.1材料超净操作台(Healforce,HFsafe1500/C),细胞培养箱(Healforce,HF90),荧光倒置显微镜(Nikon,TE2000-U),酶标仪(Bio-Rad550),Exenatide注射剂(美国BaxterPharmaceuticalSolutionsLLC),Exendin(9-39)(Sigma,E7269),胎牛血清(FBS)、DMEM培养液、青霉素-链霉素双抗、2.5g/L胰蛋白酶(Hyclone),神经细胞培养基、B-27(10889)为Invitrogen公司产品,谷氨酰胺(Sigma),重组人脑源性神经生长因子(HumanBDNF,450-02)、重组鼠睫状神经生长因子(RatCNTF,450-50)为PeproTech产品,层粘连蛋白(Sigma),多聚赖氨酸(Sciencell,0403),TritonX-100(Sigma),细胞计数试剂盒-8(CCK-8,日本同仁),Thy1.1/CD90抗体(Abcam,ab225),巨噬细胞标志物抗体(sc-66204)、GLP-1R抗体(sc-66911)为SantaCruz产品,羊抗鼠IgG(Jackson),FITC标记山羊抗兔IgG和FITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉),正常山羊血清(武汉博士德)。1.2方法1.2.1RGCs细胞培养及凋亡造模出生13d的Wistar乳鼠置于750mL/L乙醇浸泡5min,显微镜下无菌取出眼球,眼球于含100U/mL青霉素、50g/mL链霉素冷D-hank's液中冲洗3次后,放于冰浴培养皿中;将视网膜完整的分离出,并用无菌冷D-hank's液冲洗3次。在超净台内将分离出的视网膜以2.5g/L胰蛋白酶消化,并以吸管进行反复吹打,混匀成悬液后,以含100mL/LFBS的DMEM培养基进行中和,经滤网过滤,1200r/min离心5min。100mL/LFBS的DMEM培养基重悬细胞。RGCs的纯化依照一直被国外RGCs研究所采用Barres等[4]方法进行。首先重悬细胞液内加入巨噬细胞标志物抗体(稀释浓度为1100),轻轻混匀,并置于羊抗鼠IgG包被的培养皿中37孵育,去除巨噬细胞;吸取非黏附细胞悬液置于Thy1.1抗体包被的培养皿中,37孵育;轻轻吸掉未黏附的细胞悬液,PBS轻洗培养皿3次,进一步纯化RGCs;用含1.25g/L胰酶的PBS液轻轻冲洗培养皿壁,黏附于培养皿壁细胞脱落后,含100mL/LFBS的DMEM

参考文献

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