风疹病毒荧光逆转录-聚合酶链反应快速检测方法的建立

作者:吴华森;高筱萍;徐昌平;卢亦愚;冯燕 刊名:中国疫苗和免疫 上传者:李晓华

【摘要】目的建立快速、灵敏的TaqMan探针荧光逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)用于风疹病毒核酸的特异性检测。方法在风疹病毒非结构蛋白P150基因保守区域,设计特异性引物和TaqMan探针,优化荧光RT-PCR反应体系与反应条件,以提高方法的特异性和灵敏度,并应用于风疹疑似患者的临床样本检测。结果建立的荧光RT-PCR对风疹病毒检测具有高度特异性,对麻疹、流行性腮腺炎、流行性感冒等其他病毒均无交叉反应,且检测的灵敏度达0.01TCID5(050%组织培养感染剂量)/管。采用该方法从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右,且操作简便、重复性好、准确率高。结论建立的风疹病毒荧光RT-PCR高效、特异、敏感,为风疹病毒感染的早期快速检测提供了一种新的方法。

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风疹是由风疹病毒(RubellaVirus,RV)感染引起的急性出疹性呼吸道传染病。妇女在妊娠的前3个月感染RV易引起胎儿先天性风疹综合征(CongenitalRubellaSyndromes,CRS),导致流产、死产、胎儿畸形、智力低下等[1]。在临床症状上,RV引起的风疹与轻型麻疹以及一些肠道病毒感染所引起的出疹性疾病不易区分。因此,对于以优生优育为目的的产前诊断或临床诊断来讲,建立快速、敏感、准确的RV检测方法是十分必要的。近年荧光聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术在病毒等微生物检测领域得到广泛的应用,它利用PCR技术对脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid,DNA)的高效扩增并结合探针技术的高特异性和敏感性,克服了常规血清学和普通PCR方法的不足,是一种很有应用价值的诊断方法。本研究在已建立普通RT-PCR检测RV核酸的基础上,利用TaqMan荧光探针技术,建立了RV的荧光RT-PCR快速检测方法,获得了满意效果,现将结果报告如下。材料与方法1病毒株和临床样本风疹病毒Gos株、麻疹病毒沪191株、流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒TL株以及呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus,RSV)Long株,由上海生物制品研究所与中国药品生物制品检定所提供。流行性感冒(流感)病毒株甲1/北京/56/97、甲3/悉尼/5/97、乙型/深圳/12/97由中国疾病预防控制中心(CDC)提供。风疹临床疑似患者的标本,由浙江省基层CDC在风疹爆发疫情中,采集疑似患者含漱液标本送检。2病毒核糖核酸(RibonucleicAcid,RNA)提取采用德国QIAGEN公司的ReansyMiniKit,按试剂盒说明书进行提取。3引物与探针的设计从美国基因数据库(GenBank)下载不同年代与地区的20余株RV全基因组序列,用ClustalW(Version0.8)软件进行同源性比较,在RV的非结构蛋白P150基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,序列见表1。引物和探针均委托宝生物工程(大连)有限公司合成。表1荧光RT-PCR检测RV引物探针序列Table1PrimersandProbeUsedinReal-timeRT-PCRforDetectionofRubellaVirus引物及探针PrimersandProbe碱基序列Sequences(53)位置SiteRubella-FCCCAGCACTCCACGCAAT237254Rubella-RTCTTTAGGGCCCCACTCRAT280299Rubella-PbFAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ12562744荧光RT-PCR反应体系与条件的优化4.1引物与探针最佳浓度优化为避免TaqMan荧光RT-PCR反应混合物中由于引物与探针之间的浓度不当而引起非特异性竞争抑制,在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中,选用不同浓度的引物和探针,采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度与比例。4.2Mg2+浓度优化Mg2+的浓度高低对Taq酶的活性与扩增的特异性密切相关,在同一反应体系条件下改变Mg2+浓度,对Mg2+浓度进行优化。4.3Tm温度的优化用MJResearchOpticonTM2荧光定量PCR仪上的温度梯度功能,在Tm值(4862)下进行检测,选择最佳Tm温度。5荧光RT-PCR反应的敏感性RV标准毒株采用非洲绿猴肾(Vero)细胞进行病毒效价滴定后[106.3TCID50/ml(50%组织培养感染剂量/毫升)]作为参

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