小鼠Oct4基因真核表达载体的构建及表达鉴定

作者:陈天姬;杜娟;卢光琇 刊名:现代生物医学进展 上传者:赵海波

【摘要】目的:构建小鼠Oct4基因真核表达载体并对其表达进行鉴定。方法:以小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)cDNA为模板克隆Oct4基因编码区序列,将其通过定向克隆插入pcDNA3.1(+)载体多克隆酶切位点(multiple cloning sites,MCS)中,形成pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体。将pcDNA3.1(+)空载体和pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体分别转染293T细胞,通过Western Blotting检测Oct4蛋白的表达。结果:成功检测到Oct4蛋白的表达。结论:成功构建了小鼠Oct4基因真核表达载体。

全文阅读

胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ESCs)来源于囊胚期内细胞团(Innercellmass,ICM)[1],其最显著的特征是具有多向分化潜能和自我更新能力[2]。维持ESCs多向分化潜能和自我更新的分子机制是干细胞相关研究及应用的重要基础,目前已经知道干细胞的多能性和自我更新是由一些内源和外源性因子组成的一个复杂的调控网络来共同调节的[3]。其中POU转录因子家族成员Oct4是这个调控网络中最早发现的关键因子之一[4],它处于该调控网络的最上游,和Nanog,Sox2等因子一起参与维持ESCs的不分化并调控其它干细胞相关基因的表达[5]。我们从小鼠ESCs(mESCs)cDNA中克隆得到Oct4基因的编码框序列,构建了pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体,并通过West-ernBlotting验证了该载体能成功表达出Oct4蛋白。利用该真核表达载体,我们不仅可以对Oct4的功能进行进一步的深入研究,还可以开展一系列下游工作,如Oct4调控网络相关研究等。本研究为进一步研究mESCs维持不分化的分子机制提供了工作基础。1材料和方法1.1材料R1/E细胞为mESCs细胞系,293T细胞为人胚肾细胞系。pcDNA3.1(+)载体为Invitrogen公司产品。逆转录试剂盒和各Marker购自Fermentas公司。高保真PCR试剂盒,各限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自NEB公司。质粒小量制备及胶回收试剂盒购自TaKaRa公司。TrizolReagent和Lipofec-tamineTM2000购自Invitrogen公司。anti-Oct4和anti--actin一抗购自SantaCruz公司。LumiGLO誖ChemiluminescentSub-strateSystem购自KPL公司。1.2方法1.2.1Oct4基因编码区的克隆以R1/E细胞cDNA为模板对Oct4基因编码区进行扩增,引物序列如下(斜体处为酶切位点及保护碱基):上游引物:5'-ggggtaccatggctggacacctggc-3';下游引物:5'-ccgctcgagctatcagtttgaatgc-3'。上游和下游引物所带酶切位点分别为Kpn和Xho。高保真PCR50l反应体系如下:32.5l去离子水中依次加入5GCBuffer10l,10mMdNTPMix1l,10MOct4上/下游引物各2.5l,R1/E细胞cDNA1l,PhusionHDDNA酶0.5l。PCR程序为:98预变性30sec;98变性10sec,65退火30sec,72延伸40sec,重复35个循环;72补链7min;终止于4。PCR产物进行1%琼脂糖胶电泳后利用胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收。1.2.2pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体的构建及鉴定分别对pcD-NA3.1(+)空载体和切胶回收所得到的Oct4编码区片段进行Kpn和Xho双酶切,50l酶切体系为:26l去离子水中依次加入载体或片段10(l约1g),10NEBBuffer5l,10BSA5l,Kpn(10U/l)2l,Xho(20U/l)2l。37反应过夜后将各产物分别进行1%琼脂糖胶电泳后用胶回收试剂盒对酶切产物进行切胶回收。10?l连接反应体系为:3?l去离子水中依次加入回收的线性化pcDNA3.1(+)载体1l,回收的Oct4编码区片段4l,10T4连接缓冲液1l,T4DNA连接酶1l。16连接过夜后利用DH5感受态细胞进行转化。37培养过夜,次日挑取克隆进行PCR和酶切鉴定。PCR体系及程序同上(按比

参考文献

引证文献

问答

我要提问