细胞周期蛋白E1基因表达上调与胃癌发生的关系

作者:顾立强;常文军;韩一芳;蔡慧;马立业;曹广文 刊名:第二军医大学学报 上传者:李永鹏

【摘要】目的在基因和蛋白水平检测胃癌组织中细胞周期蛋白E1(CCNE1)的表达,研究其与临床病理参数的相关性,探讨其与胃癌发生发展之间的关系。方法通过Oncomine(肿瘤微阵列数据库)分析CCNE1在胃癌中的表达。采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术检测34例配对样本中CCNE1的mRNA的表达水平。采用组织芯片/组织微阵列技术结合免疫组化方法检测CCNE1在34例配对样本中的蛋白表达情况。结果胃癌原发灶CCNE1 mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(P=0.001),在胃癌组织中CCNE1 mRNA表达水平在Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期均呈现显著上调(P=0.042,P=0.016)。在胃癌原发组织中CCNE1蛋白阳性表达率[41.2%(14/34)]显著高于癌旁正常组织[0(0/34)]及胃炎组织[0(0/34)],P<0.01。CCNE1蛋白表达水平在不同分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移肿瘤的表达不同,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CCNE1表达上调可能与胃癌的发生、发展密切相关,提示CCNE1的检测可能为胃癌的诊断和预后提供参考。

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胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内占恶性肿瘤病死原因的第2位[1]。胃癌的发生是遗传因素、饮食等环境因素及幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,HP)慢性感染等多种因素共同作用的结果,与多种癌基因、抑癌基因以及细胞周期调节基因的变化密切相关[2]。细胞周期蛋白E1(cyclinE1,CCNE1)由4个外显子及3个内含子构成,可转录长度为2.2kb的mRNA,其半衰期短,大约30min[3]。CCNE1在细胞周期中的G1S期表达,通过结合并激活细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)从而调节哺乳动物细胞分裂期G1S期的过渡[4]。CCNE1-CDK2复合物的去底物磷酸化对于引发DNA复制的同步启动、中心体的复制与调节、染色体重构以及组蛋白的生物合成起重要作用[5]。过度的细胞增殖是人类肿瘤发生的标志性事件,在多种肿瘤类型中已经发现CCNE1/CDK2系统的失调[6-7]。文献[8]报道,在恶性肿瘤细胞中CC-NE1的过量表达可以加速G1期进程,减少有丝分裂细胞,加速不依赖生长因子的细胞分裂,同时导致染色体不稳定性。本实验室运用生物信息学方法分析并预测了CCNE1与胃癌的发生相关,旨在前期研究的基础上,进一步验证CCNE1在胃癌原发组织及配对癌旁正常组织中mRNA及蛋白表达差异,探究CCNE1蛋白表达变化与临床病理参数的关系,分析其在胃癌发生、发展过程中可能的分子作用机制。1材料和方法1.1CCNE1在胃癌中表达的生物信息学分析应用Oncomine基因芯片数据库(http://www.oncom-ine.org/),分析CCNE1在胃癌原发灶与配对癌旁正常组织细胞中的表达情况,发现CCNE1在胃癌细胞中的表达较在癌旁正常组织细胞中呈现明显上调(P=0.001)。1.2标本来源及资料34例经病理学确诊的胃癌标本来源于2007年9月至2009年7月第二军医大学长海医院普通外科一病区实施胃癌根治术的患者,其中男性14例,女性20例,年龄3481岁,中位年龄57.7岁。所选患者术前均未行放化疗,配对选取肿瘤原发组织、癌旁正常组织(距原发灶约5cm)以及胃炎组织。所有新鲜组织标本离体后立即经液氮冻存并迅速转移至-80冰箱保存。根据术后病理资料,组织标本确定为高分化腺癌14例(41.2%),中分化腺癌9例(26.5%),低分化腺癌11例(32.4%)。按浸润深度分为:侵及黏膜、黏膜肌层11例,侵及肌层、浆膜层13例,侵出浆膜层10例。根据TNM分期:+期16例,+期18例。组织芯片由上海芯超生物科技有限公司制备。1.3主要试剂及仪器RNA提取试剂TRIzol试剂购自Invitrogen公司;RNA反转录试剂盒购自Pro-mega公司;DNase、rTaqDNA聚合酶、2SYBRPremixExTaq购自TaKaRa公司;ReverseTranscrip-tionSystem试剂盒购自Invitrogen公司。Dako抗体稀释液、EnVisionTM+HRP鼠工作液、Dako液体DAB+底物系统购自丹麦Dako公司,H-E染色试剂盒购自Sigma公司。鼠抗人CCNE1单克隆抗体购自英国Abcam公司。实验所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。UV7504紫外分光光度仪购自上海新茂仪器有限公司。LightCycler480高通量实时荧光定量PCR系统购自罗氏公司。1.4实时荧光定量PCR检测CCNE1的mRNA表达水平1.4.1总RNA提取及反转录组织总RNA提取按TRIzol试剂说明书操作完成,用紫外分光光度仪对所提取RNA进行纯度

参考文献

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