甲状腺激素对血管内皮细胞护骨素表达的影响

作者:张军霞;向光大;孙慧伶;赵林双;侯洁 刊名:实用医学杂志 上传者:马晓斐

【摘要】目的:观察甲状腺激素对血管内皮细胞护骨素(OPG)表达的影响。方法:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分别在不同浓度甲状腺激素(0.1、1、50nmol/L,T3)条件下培养24h。ELISA法检测细胞培养液上清OPG的含量,RT-PCR法检测内皮细胞OPGmRNA的表达水平。结果:与生理浓度组T3(1nmol/L)比较,低浓度组T3(0.1nmol/L)内皮细胞培养液上清OPG的含量增加(P<0.05),OPG mRNA表达水平明显增高(P<0.05);高浓度组T3(50nmol/L)内皮细胞培养液上清OPG的含量减少(P<0.05),OPGmRNA表达水平明显降低(P<0.05)。结论:HUVEC在低浓度甲状腺激素作用下OPG表达增加,提高甲状腺激素浓度可逆转该现象。

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护骨素(osteoprotegerin,OPG)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的新成员,其主要生物学作用是抑制破骨细胞(OC)分化、活化和上调骨密度[1]。OPG不仅在骨代谢中发挥重要作用,也是心血管系统的重要调节分子。我们的研究发现[2],甲状腺机能减退症(甲减)患者体内升高的OPG水平与内皮功能紊乱有关,甲状腺激素替代治疗后血浆OPG水平下降,内皮功能改善。本研究以甲状腺激素干预体外培养的血管内皮细胞,利用RT-PCR技术观察甲状腺激素对血管内皮细胞OPGmRNA表达的影响,探讨甲状腺激素与血管内皮功能的联系。1材料与方法1.1材料甲状腺激素(3,3,5-Triiodo-L-thyroninesodiumsalt,T3)购自Sigma公司(编号T6397);低糖型DMEM干粉培养基、牛血清白蛋白购自Gibico公司,胎牛血清为Sigma公司产品,胰蛋白酶购自Diffico公司,OPG检测采用美国R&DSystems试剂盒,TRIZOL为Invitrogen公司产品,逆转录试剂盒为Formentas公司产品,KODDash酶购自TOYOBO公司。1.2细胞培养无菌条件采集健康产妇分娩后的新生儿脐带,装入含青链霉素的PBS液的容器,2h内采用酶消化法分离人脐静脉内皮细胞。胰蛋白酶浓度为0.25%,37孵育12min,胎牛血清终止酶反应,1000r/min离心10min,弃上清,加入含20%胎牛血清的低糖型DMEM培养基,重悬细胞,细胞计数板计数,以1105/mL接种于培养瓶中继续培养。内皮细胞鉴定采用因子相关抗原免疫组化染色。取24代细胞进行研究。1.3ELISA法检测细胞培养液上清OPG的含量内皮细胞以0.25%胰蛋白酶消化,制备细胞悬液,混匀后以3105/mL浓度接种于24孔板,细胞达60%70%汇片即换用含0.1%牛血清白蛋白的无血清DMEM培养液培养4h后,加入不同浓度的T3,使其终浓度分别为0.1、1、50nmol/L(根据预实验确定浓度)。继续培养24h后收集上清液,-80保存待测。ELISA法检测按试剂盒说明书进行。上述实验重复3次。1.4RT-PCR法检测细胞OPGmRNA表达取对数生长期细胞用于实验,换用含0.1%牛血清白蛋白的无血清DMEM培养液培养4h后加入不同浓度T3进行干预。细胞随机分为3组:(1)低浓度组:0.1nmol/LT3;(2)生理浓度组:1nmol/LT3;(3)高浓度组:50nmol/LT3。孵育24h后进行下述指标的检测。上述实验重复5次。以TRIZOL试剂提取细胞总RNA(1mL/25cm2培养瓶底面积),1%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪确定完整性并定量后即可用于实验。取总RNA0.5g按逆转录试剂盒说明书制备cDNA,取cDNA进行PCR扩增。引物序列设计如下:OPG上游:5-GCTAACCTCACCTTCGAG-3,下游:5-TGATTGGACCTGGTTACC-3,全长324bp;3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游:5-GCTTTTAACTCTGGCAAAGTG-3,下游:5-GATGATGACCCTTTTGGCTC-3,全长300bp。反应体系:KODbuffer(10)2.5L,dNTP(2mmd/L)2.5L,KOD酶(2.5U/L)1L,上下游引物(20mol/L)各0.5L,cDNA2L,补充灭菌三蒸水至总体积25L。反应条件:OPG退火温度58.3,GAPDH退火温度56.2,分别30cycles,最后72延伸10min,4保存。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,VL凝

参考文献

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