双歧杆菌免疫血清的制备及性质分析

资源类型:pdf 资源大小:31.00KB 文档分类:工业技术 上传者:鉴涛

文档信息

【作者】 袁耀武  张伟  马雯  李英军  林杨 

【关键词】双歧杆菌 免疫血清 ELISA 

【出版日期】2005-04-15

【摘要】通过动物免疫方法制备了长双歧(B.longum)和两歧双歧杆菌(B.bifidum)的免疫血清,经ELISA检测,血清效价达到1:1280。用此血清和乳制品中常见细菌反应,未见明显交叉反应,这一结果为双歧杆菌发酵乳制品中双歧杆菌的血清学检测提供了参考。

【刊名】食品科学

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双歧杆菌是人类及动物肠道中对机体有益的正常菌,它与机体健康状况密切相关。目前,双歧杆菌饮料及发酵乳制品在日本及西方国家市场颇为流行。但是双歧杆菌由于严格厌氧性,所以按传统的食品卫生检验方法检测起来比较繁琐。血清学检测方法是一种快速、简便的检测方法,对食品中一些细菌可以起到快速检测作用,本文旨在探讨血清学检测方法对食品中双歧杆菌检测的可行性。试验以用于发酵乳制品的长双歧杆菌(B.longum)和两歧双歧杆菌(B.bifidum)为材料,制备出两种免疫血清,并将它们与食品中常见的细菌反应,均未出现明显的交叉反应,这种结果为食品中双歧杆菌血清学的检测提供了可行性的参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种长双歧杆菌(B.longum)、两歧双歧杆菌(B.bifidum),本实验室保存。1.1.2实验动物KM小白鼠,由河北医科大学实验动物学部提供。1.1.3培养基及试剂改良MRS液体培养基,卡介苗,弗氏不完全佐剂,酶标抗鼠抗体。1.1.4设备Hungate厌氧装置,恒温培养箱。1.2试验方法1.2.1抗原制备将长双歧杆菌及两歧双歧杆菌采用Hungate厌氧培养技术[1],37℃,培养48h后,3500r/min离心30min。沉淀用生理盐水洗涤3次,将菌体稀释为1:10的菌悬液。1.2.2免疫血清的制备将长双歧杆菌及两歧双歧杆菌各2ml菌悬液分别与等量弗氏完全佐剂(弗氏不完全佐剂与卡介苗混合)充分乳化,按下面程序[2]免疫小鼠(见表1),末次免疫后一周,断头取血,分离血清。1.2.3免疫血清效价测定采用间接ELISA法:将109cfu/ml稀释的双歧杆菌菌悬液包被聚苯乙烯酶标板,4℃过夜;PBS-BSA封闭,37℃,1h;加入用PBS-BSA递进稀释的免疫血清,37℃,1h;加入酶标抗鼠抗体,37℃,1h,以上各步骤均需PBS-Tween20洗涤3次;加入新鲜配置的OPD底物溶液显色,37℃,10min,之后2mol/L浓硫酸终止反应;490nm测OD值。1.2.4免疫特异性测定采用间接ELISA法,将两种双歧杆菌免疫血清各稀释100倍分别与108cfu/ml的长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、腊样芽孢杆菌、枯草杆菌等做交叉反应,方法如1.2.3所述。1.2.5双歧杆菌的检测采用间接ELISA法,将双歧杆菌免疫血清稀释100倍与不同浓度的双歧杆菌菌悬液反应,方法如1.2.3所述。2.1效价分析通过采用间接ELISA法,测得两种双歧杆菌免疫血清不同稀释度的O D490nm值,结果见表2。从结果中可以看出,两种双歧杆菌接种小鼠,将它们制备的免疫血清稀释到1280倍,其P/N值仍然在2倍以上(P/N>2定为阳性)。由此可见,其免疫血清效价均可以达到1:1280,这个检测结果和兰景刚等[3]报道的结果相似,说明两种菌均取得了良好的免疫效果。这里之所以采用间接ELISA法而非其它方法测其效价,是因为将来我们准备采用间接ELISA法直接检测乳制品中的双歧杆菌,根据这个效价测定结果将来在检测菌体时可以找到一个适宜的血清稀释度。2.2免疫特异性分析经间接ELISA法测定,两种双歧杆菌免疫血清与上述各菌的反应结果如下(表3)。从结果可以看出,长双歧杆菌免疫血清除了与长双歧杆菌反应外,还与两歧双歧杆菌具有很强的交叉反应,此外还与金黄色葡萄球菌具有一定的交叉反应,与其它各菌反应阴性。两歧双歧杆菌免疫血清除了与两歧双歧杆菌反应外,还与长双歧杆菌具有很强的交叉反应,此外也与金黄色葡萄球菌具有一定的交叉反应,与其它各菌反应阴性。这个结果说明两种双歧杆菌具有极强的交叉反应,后经过再次间接ELISA法测试证明:长双歧杆菌与两歧双歧杆菌免疫血清的异源血清效价可达1:640,两歧双歧杆菌与长双歧杆菌免疫血清的异源血清效价可达1:320。对于长双歧杆菌免疫血清与金黄色葡萄球菌具有一定的交叉反应,这个检测结果和孙震等[4]报道的结果略有不同,对此可能是由于同笼小鼠咬尾引起金黄色葡萄球菌感染所致,或是SPA蛋白(葡萄球菌A蛋白)非特异性吸附所致,对此还需进一步证实。2.3双歧杆菌检测结果分析经间接ELISA法测定,两种双歧杆菌的检测结果如下(见表4)。从检测结果中可以看出:通过间接ELISA法可以测出双歧杆菌的最低浓度为105(cfu/ml)。这个检测结果和孙震等[4]报道的结果相似。说明采用直接包被菌体的间接ELISA法检测菌体是可行的,而且具有较高的灵敏度。这就为将来用间接ELISA法直接检测发酵乳制品、饮料等中的双歧杆菌提供了可行性的依据。组别Groups菌浓度Consistency(cfu/ml)103104105106107108B.longum--++++B.bifidum--++++表4两种双歧杆菌的检测结果Table4Examination of B.Longum and B.bifidum3讨论通过试验证明,利用双歧杆菌免疫动物可以产生抗体,而且可以通过间接ELISA法和双歧杆菌具有很好的反应性。此外,这种抗体和乳制品中很多常见细菌没有交叉反应,这种结果为食品中双歧杆菌血清学的检测提供了可行性的参考。但是考虑到乳制品中诸多因素的影响,如酸度、乳脂、乳蛋白等,具体在食品中双歧杆菌的检测方法还需进一步试验。在免疫特异性试验中我们选择的供试杂菌数量级为108cfu/ml,是因为一般细菌细胞通过ELISA法检测的范围在106~108,如果供试杂菌在这个数量级下和免疫血清没有交叉反应,就不会影响到双歧杆菌的检测,而且食品中污染菌一般也不达到这个数量级,所以食品中一些杂菌对双歧菌的检验不会造成影响。发酵乳制品中嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌是常见菌,常和双歧菌同时作为发酵菌,所以其数量级可能会超过108cfu/ml,对此我们以1012cfu/ml高浓度菌悬液进行了检测,仍未见交叉反应,所以它们也不会影响到双歧菌的检验。对于两种双歧杆菌交叉反应的问题,对双歧杆菌发酵食品的检测也无太大影响,因为一般来说没有区分这两种菌的必要。双歧杆菌免疫血清的制备及性质分析@袁耀武$河北农业大学食品科技学院!河北保定071001 @张伟$河北农业大学食品科技学院!河北保定071001 @马雯$河北农业大学食品科技学院!河北保定071001 @李英军$河北农业大学食品科技学院!河北保定071001 @林杨$河北农业大学食品科技学院!河北保定071001双歧杆菌;;免疫血清;;ELISA通过动物免疫方法制备了长双歧(B.longum)和两歧双歧杆菌(B.bifidum)的免疫血清,经ELISA检测,血清效价达到1:1280。用此血清和乳制品中常见细菌反应,未见明显交叉反应,这一结果为双歧杆菌发酵乳制品中双歧杆菌的血清学检测提供了参考。[1]李平兰,张篪.利用亨盖特厌氧滚管技术检测双歧杆菌制品中的活菌数[J].食品科学,1999,(2):68-69. [2]袁耀武,张伟,李英军,等.甲型副伤寒沙门氏菌体抗原抗血清的简易提纯[J].免疫学杂志,2003,19(3):45-47. [3]兰景刚,胡宏.双歧杆菌抗体制备方法的探讨[J].中国微生态学杂志,1996,8(2):58-60. [4]孙震,张灏,解晴,等.双歧杆菌免疫学检测方法的研究[J].无锡轻工大学学报,1999,18(2):28-32.

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