靶向Midkine基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

作者:孙梅;谢淑丽;张兴义;李玉林 刊名:中国老年学杂志 上传者:黄国才

【摘要】目的构建靶向midkine基因的siRNA的表达载体,为研究midkine在肿瘤中作用提供一个新的方向。方法根据基因库中midkinecDNA序列设计和合成针对人midkine基因的siRNA寡核苷酸,定向克隆入质粒载体PGCsiU6,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。结果酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向midkine基因表达的siRNA干扰质粒载体PGCsiU6/midkine,为进一步运用RNA干扰技术进行midkine基因功能研究奠定了基础。

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Midkine(MK)基因是1988年日本学者Kadomasu等在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM-1细胞cDNA文库中发现的一种新基因,其表达产物在体内的分布随胚胎发育而变化,胚胎发育早期至中期时,MK在多种组织中表达,以后表达逐渐下降至局限化,它具有促进细胞恶性转化,和较强的促血管生成、增强纤溶作用和抑制细胞凋亡1。近年的研究发现,MK在多数肿瘤组织中高表达2,因此受到肿瘤研究者们的重点关注。目前,国内已有报道MK在大肠杆菌中表达载体的构建3,但还未见MK在真核表达载体构建的报道。本研究应用RNA干扰(siRNA)技术,构建MK真核表达质粒并鉴定,为研究MK基因在肿瘤中的作用提供有效的实验工具。1材料与方法1.1主要材料来源大肠杆菌DH-5均由本实验室保存。质粒PGCsi-U6质粒由美国哈佛大学杨惠钟教授惠赠;限制性内切酶BamH和Hind及T4DNA连接酶购自大连宝生物有限公司。去内毒素质粒提取试剂盒购自Qiagen公司;逆转录试剂盒购自沈阳联星生物公司。DNA胶回收试剂盒购自北京鼎国生物技术发展公司,引物合成和DNA序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司提供;Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。1.2设计和构建siRNA表达质粒从GenBank数据库中获取人MKmRNA的序列全长(acessmumber:BC011704),选择最适宜的引物序列:上游5-UGAAGAAGGCGCGCUACAAUGCUCA-3(正义链),5-UGAGCAUUGUAGCGCGCCUUCUUCA-3(反义链),确定了siRNA序列,按照Elbashir等4和Tuschl5的方法设计shRNA(short-hairpinRNA)。siRNA的正义链与反义链,中间以9个脱氧核苷酸的Loop(TTCAAGAGA)结构相连,后面接有RNApoly聚合酶转录中止位点,同时模板链两端分别设计BamH和Hind酶切位点。随之将DNA模板单链1(浓度1g/l)1l和DNA模板单链2(浓度1g/l)各1l加入20SSC1l和H2O17l中形成20l反应体系,混匀,95加热10min,取出置室温1h,退火,便得到双链DNA插入片段,-20保存备用。1.3RNA干扰质粒载体的构建用PGCsi-U6双酶切线性化PGCsi-U6质粒表达载体,反应体系:BamH1l,Hind1l,multicorebuffer2l,BSA1l,质粒1g,H2O14l。混匀,37温浴2h。然后将酶切混合物在10g/L琼脂糖凝胶上电泳,切胶,回收线性载体,用DNA凝胶纯化试剂盒纯化。把siRNA插入片段20ng和线性载体1l、10T4DNA连接酶缓冲液1l、T4DNA连接酶1l、H2O5l,混匀,37水浴过夜。将5l连接产物转化200l大肠杆菌DH-5,在LBAmp培养基上涂板,37培养过夜。挑取3~5个细菌克隆抽提质粒,扩增,质粒抽提试剂盒提取质粒。1.4重组质粒载体的鉴定取空质粒和重组质粒各1gBamH和Hind行双酶切,酶切体系和条件同线性化空质粒的体系和条件。各取不同组0.5g质粒进行PCR扩增,所用引物序列:5-GCTACAATGCTCAGTGCCATT-3(正链),5-AAT-GGCACTGAGCATTGTAGC-3。反应体系:质粒0.5g,10PCRbuffer2.5l,25mmol/LMgCl22l,10mmol/LdNTP0.5l,5u/lTaqDNA聚合酶0.5l,10mmol/L引物各0.5l,加重蒸馏水补足反应总体积至25l。扩增条件:945min热启动,9430s变

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