小鼠SLC基因真核表达载体的构建及其趋化活性鉴定

作者:马飞;张叔人;宁力;孙文欣;梁肖;张雪艳;付明;林晨 刊名:细胞与分子免疫学杂志 上传者:郑显凤

【摘要】目的:克隆小鼠次级淋巴样组织趋化因子(secondary lymph-oid-tissue chemokine,SLC)基因,并构建真核表达载体。在体 内外检测该表达载体表达产物的免疫趋化功能。方法:用RT-PCR从C57BL/6小鼠胸腺组织中克隆小鼠SLC基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-mSLC。在体外,用基因枪转染小鼠黑色素瘤B16F10细胞;RT-PCR检测转染细胞有SLC的表达;利用趋化小室法,检测表达产物针对淋巴细胞的趋化活性。在体内,用基因枪通过小鼠皮肤局部转染SLC基因,观察转染局部淋巴细胞的浸润。结果:克隆的基因经测序证实,为小鼠SLC基因Scya21b型。转染SLC基因的B16F10细胞体外培养48 h后,RT-PCR检测到SLC的表达,同时培养基上清具有针对淋巴细胞的趋化活性。通过基因枪局部转染小鼠皮肤,24 h后皮肤病理检查显示,局部皮内有明显的淋巴细胞浸润。结论:从小鼠胸腺组织中克隆到小鼠SLC基因,构建的真核表达载体pcDNA3.1-mSLC在体内外均可以表达,并具有针对淋巴细胞的趋化活性。

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次级淋巴样组织趋化因子(seeonda巧lymphoid一tiosueehe-mokine,SLC)是一种T细胞特异性趋化因子,对NK细胞和成熟的Dc也具有一定的趋化作用’,。T、NK细胞和Dc是在机体抗肿瘤免疫中重要的3种效应细胞,特别是T细胞,在肿瘤的细胞免疫应答中发挥着关键性作用。理论上讲,任何一种募集免疫效应细胞进人肿瘤组织中的趋化因子,都可通过增强机体免疫应答发挥治疗肿瘤的作用。因此,SLC在抗肿瘤免疫治疗领域具有广阔的研究前景2’。本实验中,我们克隆了小鼠sLc基因,构建了其真核表达载体,并且在体内外研究了这一载体的表达及其产物对淋巴细胞的趋化活性。1材料和方法1.1材料C57BU6小鼠,7一8wk龄,购自中国医学科学院实验动物研究所。B16F10小鼠黑色素瘤细胞,由本所常规传代培养。真核表达载体PcDNA3.1,由本所保存。pMD18一TveCtolDNA,购自宝生物公司。洲201RNA提取试剂盒,购自LifeTeChnologies公司。Helios基因枪系统与金颗粒(直径l6卜m),均购自BIO一RAD公司。趋化小室与多聚碳酸醋膜(5.0林m孔径,25mmXSOmm),均购自Neutroprob。公司。1.2方法1.2.1小鼠SLC基因的克隆取C57B口6小鼠胸腺组织,用TrizolRNA提取试剂盒提取胸腺总RNA。取6林g总RNA与住5林901190一dT15混合,逆转录获得CDNA。以其作为模板,PCR扩增SLC基因。PCR中所用的上游引物为:5‘一GCATC-CATGGCTCAGATGATC一3‘(含BaoHI位点);下游引物为:ISSN1007一8738细胞与分子免疫学杂志ChinJCellMolImmunol)2003.19(七伪51一GAA盯CTATCCTC竹GAGGGC一3’(含EcoRI位点),扩上产物的大小预计为413bp。反应体系共25林L,引物的浓坦为l林m亦玩扩增条件为:9430“,4830队72305共3。个循环。拟曾产物进行15酬L的琼月瓣凝胶电泳分析将扩增产物直接插人载体pMD18一T,构建重组质粒pMD18一msLC,并利角载体pMD18一T上携带的Rv一M测序引物,进千全白动测序鉴定。L2.2真核表达载体的构建将侧序鉴定正确的小鼠SL基因,用BamHI和Ec0RI从重组质粒PMD18-T-msLC上七下,并利用同样两个酶切位点,将其插人质粒Pc.NA3l,本建出含有小鼠SLc基因的真核表达载体PcDNA3.1一m弘Co起其转化DH5a感受态菌,提取质粒并酶切鉴定,再以紫外分夕拼取然藕圣燕翼翅省:患…燕的细胞,力求轰击面覆盖整个平皿。立即加人RPMll640声全培养基,置37斌50m口Lc仇孵育箱中继续培养。48{后,培养细胞通过RT一PcR的方法检测sLC的表达。同时琳集转基因细胞培养基上清,用以检测其对淋巴细胞的趋化活性:l.2件转染细胞的RT一PCR检测采用TrizolRNA提取试齐盒,提取转染一SLC基因的B16FI。细胞的总RNA,利用RTPcR法扩增目的片段。反应步骤为:37lh,72smin完缸转录侧变性30。,48退火30,72延仍0s循环30次完成PCR后,72充分延伸10min。R肚PcR弓撇同克隆SLC基因的引物;小鼠p一actln内对照的上游引物为:5’一TGT以TGGTGG以ArrGGOTCGG一3’,下游引物为:夕一mGATGTcAcGcAcGA卿cc-31,产锹小为514饰。1.2.5趋化活性的检测利用趋化小室法川,体外检测轶基因细胞培养基上清的趋化活性。取C57B口

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