杆状病毒反式激活蛋白IE-1诱导昆虫细胞凋亡及几种抑制剂对AcNPV诱导细胞凋亡的影响

作者:杜昌升;彭建新;洪华珠 刊名:病毒学报 上传者:王巧明

【摘要】为了探讨杆状病毒诱导细胞凋亡的机制 ,用含AcNPV - ie- 1基因的重组质粒 pGAM -ie- 1转染斜纹夜蛾细胞SL - 1和粉纹夜蛾细胞Tn - 5B1。转染后 2 4h通过光镜观察、DAPI荧光染料染色、DNA琼脂糖凝胶电泳等发现 ,SL - 1发生了典型的凋亡 ,而同样的现象并没有在Tn - 5B1细胞中出现。利用放线菌酮 (cycloheximide,CHX)、莫能菌素 (Monensin)及蚜栖菌素 (aphidicolin)处理AcNPV感染的SL - 1细胞 ,发现细胞凋亡被莫能菌素及蚜栖菌素抑制 ,被放线菌酮推迟。此结果为进一步研究杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡的机制等奠定了基础。

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杆状病毒是一类在自然界中仅感染节肢动物的病毒,用它处理的昆虫细胞一般有四种结果,即转化、持续感染、潜伏感染以及死亡。它导致的昆虫细胞死亡有两种形式,即细胞坏死和细胞凋亡。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(,)可感染多种细胞,而缺失35基因的却可以诱导多种细胞的凋亡。在此过程中,当加入一种可以抑制复制的蚜栖菌素时,凋亡被阻断。蚜栖菌素的加入可阻断凋亡说明,缺失35基因的诱导的细胞凋亡与复制本身或与之相关的晚期基因表达启动了凋亡程序[1]。由此可见,的复制与细胞凋亡密切相关。有人用瞬时复制实验鉴定了9个与杆状病毒复制相关基因[2,3],发现其中的35基因为一种抗细胞凋亡的基因,而另一个重要组分-1基因的表达产物-1,在瞬时表达实验中具有强烈的转录激活作用[4],可直接与序列结合增强早期基因的表达[5,6]。另有研究显示,单纯-1基因的瞬时表达也可以诱导细胞凋亡[7]。继本实验室发现及鉴定和芹菜夜蛾核型多角体病毒(,)诱导斜纹夜蛾()-1细胞两个凋亡系统之后[8],我们在此基础上,研究了-1基因诱导-1细胞凋亡,几种抑制剂对杆状病毒诱导凋亡的影响等,以期探讨杆状病毒诱导细胞凋亡的机制,现将结果报道如下。材料与方法1细胞及其培养-1细胞(中山大学国家生物防治重点实验室赠予)和-51(美国康乃尔大学博士赠予)细胞单层培养于辅加03%水解乳蛋白、03%酵母提取物及5%胎牛血清的培养基中,均置2培养箱28恒温培养,细胞按常规方法传代。2抑制剂处理取对数生长期细胞,用(由美国农业部生防室惠赠)感染,同时分别加入10/的放线菌酮(,,)、10/的莫能菌素(,)及05/的蚜栖菌素(,),并分别在感染后1、2、3天用苔盼蓝拒染实验对细胞记数,结合显微镜观察计算细胞存活率。提取细胞进行琼脂糖凝胶电泳。3质粒的扩增重组质粒--1(武汉大学刘德立博士赠予)转化大肠杆菌-5,涂平板后抗生素筛选阳性菌落,大量繁殖细菌后常规碱裂解法提取质粒。质粒悬在无菌水中-20保存备用。4脂质体介导质粒转染-1细胞脂质体购自公司,转染方法参照说明书进行。于6孔板中接种对数生长期细胞,28培养至细胞形成单层;加025基础培养基于聚苯乙烯管中,再加入1质粒(对照细胞此处加入无菌水),轻轻摇匀,静置。同时加025基础培养基于聚苯乙烯管中,再加入脂质体10,轻轻摇匀,静止5后,将含脂质体的培养基吸入含质粒的培养基中轻轻摇匀,室温静止20;吸去6孔板中培养基,用无血清培养基洗1次,再加入配好的质粒-脂质体复合物,于28培养4后,每孔中补加含5%和双抗的新鲜培养基,28继续培养;24后镜检并收集细胞用于进一步分析。5细胞荧光染色参照文献[9]略有改动,首先将盖玻片置于直径36小培养皿中高压灭菌,接种细胞于小培养皿中,细胞生长至对数期即可接种病毒。细胞染色时首先移去培养液,洗涤1次,37%甲醛固定30,乙醇梯度脱水,4/(4,6--2,购自公司)染色(2030)。取出盖玻片,倒扣于载玻片上,荧光显微镜(激发波长340380,阻隐波长435485)下观察拍照。6细胞的提取与电泳刮下细胞,2000/离心10,弃上清液,沉淀细胞,加洗涤1次。离心后悬在(10/-,1/,80,1%)中,加蛋白酶至终浓度为50/,37水浴至混合物变清亮。然后依次用酚,酚:氯仿:异戊醇(25241),氯仿:异戊醇(241)抽提,取水相,加25倍冷体积无水乙醇,-20过夜沉淀,12000/离心10,70%乙醇洗涤沉淀,自然干燥后悬在(10/-,1/,50/,80)溶液37保温2。15%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下检测电泳结果、拍照。结果1抑制剂对

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