微小RNA-1908对肺癌细胞A549细胞周期和靶基因的调控

作者:洪伟伟;马书梅;彭慧;隋静;张艳秋;李成云;梁戈玉 刊名:环境与职业医学 上传者:张建楠

【摘要】[目的]探讨微小RNA(micro RNA,miRNA/miR)1908对肺癌细胞A549的细胞周期及靶基因的调控作用。[方法]通过慢病毒转染方法,上调A549细胞中miR-1908的表达水平,运用噻唑蓝法和流式细胞技术检测miR-1908对A549细胞增殖、周期和凋亡的影响。应用DIANA-TOOLs及KEGG数据库对miR-1908进行生物信息学分析,探讨其可能参与的信号通路和潜在靶基因。应用RT-q PCR和Western blot技术检测miR-1908对预测靶基因mR NA和蛋白表达水平的调控。[结果]与阴性对照组相比,转染组上调miR-1908表达可引起A549细胞G2期阻滞,S期减少(P〈0.05),对细胞增殖和凋亡无明显影响(P〉0.05)。miR-1908主要参与MAPK信号通路的调控,蛋白磷酸酶5(PP5)基因为其重要的潜在靶基因。与阴性对照组相比,转染组上调miR-1908表达可引起PP5的蛋白表达增加(P〈0.05),但其mR NA表达无明显改变(P〉0.05)。[结论]miR-1908可能通过对PP5基因正向调控或间接调控影响A549细胞周期,研究结果加深了对miRNAs在肺癌细胞中的作用及其机制的理解,并为miRNAs在肺癌中的进一步研究提供线索。

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微小RNA(micro RNA,mi RNA/mi R)是一类长度约22个核酸的非编码内源性小RNA,可通过与靶基因m RNA互补序列相结合,调控基因表达[1]。一般通过降低m RNA稳定性或抑制翻译,降低蛋白的表达,进而改变生物学功能。mi RNAs参与了细胞分化、增殖、凋亡和侵袭等多种功能调控[2]。既往研究表明,mi RNAs与癌症的发生发展关系极为密切。例如,mi R-27a参与了肝癌、胃癌发生发展的调控,mi R-146a与乳腺癌、卵巢癌的进展和预后相关[3-6]。肺癌相关的mi RNAs也不断被发现,如mi R-638、mi R-221、mi R-148b等均参与肺癌的调控[7-9]。mi R-1908于2008年在人类胚胎干细胞中首次被发现,它位于人类第11号染色体上FADS1基因的第1个内含子内[10]。研究发现,mi R-1908与肝癌、胶质瘤和黑色素瘤等肿瘤的发展、转移及预后相关[11-13]。有研究表明原发性肺癌患者血清中mi R-1908水平比正常对照低[14]。目前,有关mi R-1908与肺癌的研究极少,其在肺癌中的生物学作用和相关机制尚不明确。本研究通过探讨mi R-1908对肺腺癌细胞A549的细胞周期及靶基因的调控作用,进一步了解mi RNAs对肺癌细胞的作用及机制,并为mi RNAs在肺癌中的研究提供线索。1材料与方法1.1实验细胞人肺腺癌细胞A549,购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。1.2实验方法1.2.1细胞培养A549细胞采用常规传代培养,用DMEM高糖培养基(含体积分数10%的胎牛血清)于37℃、5%(体积分数,后同)CO2条件下培养,每天换液1次。使用质量分数0.02%的EDTA和质量分数0.25%的胰蛋白酶,以体积比1∶1混合,对细胞进行消化、传代。每日用倒置显微镜观察细胞生长情况,取生长状态良好的对数生长期细胞进行试验。1.2.2细胞转染按照上海吉凯基因化学技术有限公司提供的慢病毒实验操作手册进行,采用MOI=10(即感染时病毒与细胞数量的比值为10)的转染剂量。取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为5×104个/m L,接种1×105个细胞至6孔板培养孔中,在37℃、5%CO2的培养箱中培养,当细胞的融合度为20%~30%时进行转染。实验分3组,2个转染组加入相应慢病毒、聚凝胺和增强感染溶液,空白组采取常规培养,不做处理,每组同时设3个平行。3组分别为:(1)转染组(加入载有mi R-1908的慢病毒);(2)阴性对照组(加入未载有mi R-1908的慢病毒);(3)空白组。具体方法如下:(1)稀释慢病毒,使用增强感染溶液将慢病毒滴度调整为1×108 TU/m L,轻轻混匀;(2)稀释聚凝胺,使用增强感染溶液稀释聚凝胺,至最终质量浓度为500μg/m L;(3)制备混合液,将60μL稀释的慢病毒和30μL稀释的聚凝胺加入910μL完全培养基中,充分混匀;(4)弃去6孔板中的培养液,每孔加入1 000μL的混合液,此时每孔转染慢病毒的最终滴度为2×106 TU/m L;(5)37℃、5%CO2条件下培养12 h后,观察细胞状态,并且更换为新鲜培养基。转染3~4 d且细胞融合度达到80%以上时终止培养,验证转染效果和测定细胞增殖情况。1.2.3转染效果验证用生物导航仪(Olympus,日本)观察有绿色荧光的细胞数量,通过与相同区域内细胞总数比对,计算成功转染细胞的比例。用Trizol试剂(Invitrogen,美国)从实验细胞中提取总RNA。mi R-1908的逆转录引物和上下游引物由广州市锐博生

参考文献

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