硒对氟致大鼠肾小管上皮细胞线粒体膜电位改变的拮抗作用

作者:常凯;王裕;庞文彪;高继萍;陈朝阳;宋国华 刊名:实验动物与比较医学 上传者:凌华志

【摘要】目的探究硒对氟致大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)线粒体膜电位改变的拮抗作用。方法实验共设4组:染氟组(5mg/L和20mg/L的氟化钠)、染硒组(0.0171mg/L和0.0342mg/L的亚硒酸钠)、硒干预纽(氟化钠和亚硒酸钠联合干预)和对照组,按照分组干预NRK-52E细胞48h。流式细胞仪检测其线粒体膜电位,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和总抗氧化力(T-AOC)测试盒测定酶的活性。结果与对照组比,随着氟化钠浓度的升高,染氟组NRK-52E细胞线粒体膜电位下降(P〈0.05或P〈0.01)且SOD、T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P〈0.05或P〈0.01)。与染氟组相比,相对应的硒干预组线粒体膜电位升高fP〈0.01)。与20mg/L的染氟组比较,相对应硒干预纽的S0D、T-A0c、GSH-PX和CAT酶活性均升高(P〈0.05)。与0.0171mg/L染硒组相比,相对应的硒干预组线粒体膜电位降低(P〈0.01)且T-AOC、GSH-PX和CAT酶活性均降低(P〈0.01或P〈0.05)。5mg/L加氟组与加硒组相比,线粒体膜电位显著变化(P〈0.01),但SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均无显著变化。20mg/L加氟组与加硒组相比,线粒体膜电位具有显著性差异(P〈0.01)且SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC酶活性均有显著性差异(P〈O.01)。结论一定浓度的硒可以拮抗氟诱导大鼠肾小管上皮细胞线粒体膜电位下降,可能通过恢复抗氧化酶活性实现。

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我国是地方性氟病较严重的国家之一,长期暴露于高氟可引起机体慢性氟中毒[1]。对慢性氟中毒的大鼠体内自由基含量检测,结果表明损伤的主要原因是氟中毒时自由基含量上升[2-4]。自由基攻击生物膜系统,会导致线粒体受损和生物膜脂质的过氧化m。线粒体的氧化损伤与慢性氟中毒关系密切?。线粒体结构和功能异常改变可能是因为慢性氟中毒而引起的氧化应激水平升高[3,M]。微量元素硒是维持生命活动所必须的,杨克敌等n?早在 1998年的研究已表明一定剂量的硒可拮抗氟中毒,这一结论被许多学者所支持[1144]。Miao等_用不同浓度的含硒水饲喂大鼠表明,氟化钠+砸组较氟化钠组的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性高。本文将探究砸对氟致NRK-52E细胞线粒体膜电位改变是否具有拮抗作用。本实验以大鼠肾小管上皮细胞为载体,以不同浓度的氟化钠(NaF)(5 mg/L、20 mg/L)和亚硒酸钠(Na2SeO3)(0_0 171 mg/L、0.0 342 mg/L)处理大鼠肾小管上皮细胞48 h,然后对其线粒体膜电位和一类抗氧化酶系统包括:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、GSH-PX和总抗氧化力(T-AOC)[16,17i进行检测,旨在探究硒对氟致NRK-52E细胞线粒体膜电位改变的作用,为抗氟药物的开发和应用提供参考数据。 l材料与方法i.i细胞系来源及培养本实验所用的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)购自于中国科学院上海细胞库[12]。将大鼠肾小管上皮细胞置于37°C、体积分数5%C02的培养箱中培养,使用含体积分数10%灭活胎牛血清,体积分数1%青链霉素的DMEM高糖培养基。1.2主要试剂胎牛血清(杭州四季青公司),NaF分析纯(天津市博迪化工有限责任公司),Na2Se03分析纯(购自天津市化学试剂厂),线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),冰醋酸、SOD、GSH-PX、CAT和T-AOC测定试剂盒(均购于南京建成生物工程研究所)。1.3细胞的分组及处理NRK-52E细胞的具体分组情况见表1。大鼠肾小管上皮细胞细胞按1 X 105/mL的密度接种于6孔培养板,每孔培养液3 mL。待细胞全部贴壁后,再用PBS洗涤2次,按照表1的分组方法进行给药,处理48 h。表1实验分组情况Table 1 Experimental group mg/L组别NaFNa2Se〇3对照组00加氟组50200加硒组00.017100.0342硒干预组50.017150.0342200.0171200.03421.4线粒体膜电位的测定NRK-52E细胞给药处理48 h后,用PBS洗涤2次(2 000 X g、离心5 min),收集细胞;加入500 pL培养液和JC-1染色工作液,颠倒混匀,然后置于37°C、体积分数5%C02的培养箱中孵育20 min;孵育结束后,600 X g 4°C离心3~4 min,沉淀细胞;弃上清用JC-1染色缓冲液(IX)洗涤2次,600 X^41离心3~4 min;250叫JC-1染色缓冲液(1 X)重悬细胞,用流式细胞仪分析,记录好实验结果。1.5氧化应激指标的测定按照表1的分组方法对NRK-52E细胞进行给药,测定大鼠肾小管上皮细胞的应激指标,包括:SOD值、GSH-PX值、CAT值和T-AOC值。具体操作方法参见SOD测试盒、GSH-PX测试盒、CAT测试盒和T-AOC测定试剂盒说明书进行。1.6统计学分析实验数据采用SPSS19.0软件进行分析处理,以均数土标准差(3E±4表示。方差齐的多组比较采用单因素方差分析(one-w

参考文献

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