ZFP36L1通过下调细胞周期蛋白D1抑制舌癌细胞增殖

作者:罗利云;凌莉;王潇蓉;石乐娟;宋莹;郑国沛;李楠; 刊名:中国生物化学与分子生物学报 上传者:丁忠维

【摘要】C3H1型的锌指蛋白36 (zinc finger protein 36,C3H type-like 1,ZFP36L1)是一种高度保守且具有CCCH型RNA结合结构域的蛋白质。近年来,ZFP36L1在多种肿瘤中的作用被报道,但是在舌癌中的表达型和作用机制尚不清楚。Western印记结合荧光定量PCR检测发现,ZFP36L1在舌癌细胞中的表达明显低于人永生化表皮细胞Hacat。在相对低表达ZFP36L1的舌癌细胞SCC15和SCC25中,稳定过表达ZFP36L1,细胞计数实验发现,SCC15细胞的数目由(4.768±0.09225)×10~3个降低到(3.089±0.09745)×10~3个,SCC25细胞的数目由(6.274±0.01311)×10~3个降低到(4.037±0.01173)×10~3个;平板克隆实验提示,SCC15和SCC25细胞克隆数目是对照组的0.67倍,0.68倍,0.7倍和0.59倍,0.57倍,0.59倍;过表达ZFP36L1组G_1期的SCC15和SCC25细胞分别由61.82±0.8933%增加到88.72%±0.8378,由56.31%±1.029增加到71.7%±0.9303;而S期的细胞由25.21%±0.9865减少到11.31%±0.6567,由28.58%±0.8182减少到18.61%±0.6798。过表达ZFP36L1能明显下调SCC15和SCC25细胞中细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的蛋白质水平。过表达ZFP36L1组的SCC15和SCC25细胞中,细胞周期蛋白D1 mRNA的表达量分别是对照组的0.217倍和0.175倍。在舌癌细胞中,上调细胞周期蛋白D1的表达水平可消除由过表达ZFP36L1引起的细胞增殖能力降低。总之,ZFP36L1在舌癌中呈低表达;可通过下调细胞周期蛋白D1的表达,抑制舌癌细胞增殖。

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舌癌是常见的口腔癌症,其中大多数为鳞状细胞癌。近年来,舌癌的发病率和死亡率呈上升趋势。据2011年美国癌症统计数据显示,舌癌新发病例有12 060例,死亡病例有2 030例[1]。2015年我国的癌症数据提示,大约有48 100例的舌癌新发病例,舌癌新增死亡病例22 100例[2-3]。舌癌进展迅速且易发生远处转移,给临床治疗带来了极大的困难。因此,寻找舌癌发生发展中的关键分子,探究舌癌的发病机制,这对降低舌癌的发病率和死亡率具有重要的意义。 锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP)是真核生物基因中编码最多的一类蛋白质,也是人类基因组中最大的转录因子家族[4]。ZFP36家族被认为是调控基因精确表达的重要靶点,具有高度保守的CCCH型锌指结构域,它可与定位于mRNAs的3′非翻译区(3′-UTRs)的AU富集元件(AREs)结合,在转录后水平促进mRNA降解来调节基因的表达[5-6]。ZFP36、ZFP36L1和ZFP36L2在早期发育淋巴细胞中广泛表达,在调控细胞周期蛋白质和细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdks)的表达及细胞增殖方面发挥非常重要的作用[7-8]。本实验室前期研究发现,ZFP36L1在舌癌细胞中的表达水平明显低于正常舌上皮细胞。因此,推测ZFP36L1可能参与舌癌的发生发展,本文拟通过一系列的实验,研究ZFP36L1对舌癌细胞增殖和克隆形成能力以及细胞周期的影响,为阐明ZFP36L1在舌癌发生发展中的作用及其分子机制提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 人永生化表皮细胞Hacat和舌癌细胞SCC-9、SCC15、SCC25、Tca-8113和CAL27由本实验室保存,Hacat、SCC-9、SCC15、Tca-8113、CAL27细胞接种于含10%胎牛血清(Biological Industries公司)的1640(Gibco公司)培养基中,HEK-293T和SCC25细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM(Gibco公司)培养基中,放入37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养,2 d换液1次,取对数生长期细胞进行后续实验。 1.2 实时荧光定量PCR 用RNA Isolation Kit I试剂盒(Omega公司)提取细胞总RNA,测定RNA浓度。用Fermentas逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA,其体系如下:RNA 4 μg,Oligo(dT)18 引物1 μL,水补齐12 μL,于PCR仪上,65℃ 5 min,立即置于冰上2~3 min。再加入5×反应缓冲液 4 μL,Ribolock RNase 抑制剂1 μL,10 mmol/L dNTP Mix 2 μL,RevertAid M-MuLV RT 1 μL,于PCR仪上。25℃ 5 min,42℃ 60 min,70℃ 5 min。再用Fermentas公司生产的实时荧光定量PCR检测试剂盒检测相关基因的表达。其体系如下:SYBR 7.5 μL,Forward primer 0.75 μL,Reverse primer 0.75 μL,cDNA 1 μL,无核酶水5 μL。在荧光定量PCR仪(BioRad)上检测,程序如下:50℃ 2 min,95℃ 2 min,95℃ 15 s,60℃ 30 s(40个循环)。根据2-ΔΔct殖计算相对表达量。引物序列见Table 1。 1.3 慢病毒包装和稳定细胞株的筛选 ZFP36L1过表达载体和阴性对照,慢病毒包装试剂盒(Lenti-Pac HIV expression pack

参考文献

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