洛阳烟区烟株根围抗烟草疫霉放线菌的筛选与鉴定

作者:陈奇园;丁钥琪;赵世民;李淑君;康业斌; 刊名:烟草科技 上传者:千素兰

【摘要】为筛选对烟草疫霉具有拮抗作用的放线菌菌株,有效防治烟草黑胫病,对洛阳烟区烟株根围土壤中分离的放线菌采用改良平板对峙法与菌丝生长速率法测定了供试菌株及其发酵液对烟草疫霉的拮抗作用,并通过形态学观察、生理生化测定及16S rDNA序列分析鉴定了优势拮抗放线菌的种类。结果表明:在获得的227个放线菌单菌落中,8个菌株的发酵液对烟草疫霉菌丝生长的抑制率达100%,被确定为优势拮抗放线菌。根据这些菌株的形态学观察、生理生化反应与16S rDNA序列分析结果,将菌株YY75鉴定为鲁萨链霉菌(Streptomyces lucensis),菌株YY124、YY135鉴定为高贵链霉菌(S. nobilis),菌株LN204、LN221、LN247鉴定为娄彻链霉菌(S. rochei),菌株SX92鉴定为珊瑚链霉菌(S. coralus),菌株SX59鉴定为金黄回旋链霉(S. aureoverticillatus),均属于放线菌门、放线菌纲、链霉菌目、链霉菌科、链霉菌属。

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3.河南省农科院许昌烟草研究所,河南省许昌市魏都区永昌大道461000由烟草疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)侵染烟草引起的黑胫病是一种分布广泛、危害严重的毁灭性土传真菌病害[1]。目前,烟草黑胫病的防治措施主要采用种植抗病品种、合理轮作与药剂防治。然而,随着烟草栽培制度的改变,抗病品种连年、大面积单一种植,极易导致其抗病性丧失。生产上常用的甲霜灵等几种内吸性杀菌剂对烟草疫霉作用位点单一,容易产生抗药性而引起药效下降,从而导致药剂用量加大,使烟叶中的农药残留增加、造成环境污染[2-4]。近年来,国内外学者相继开展了拮抗放线菌防治烟草病害的研究。Lukic等[5]从烟田土壤中分离出28株放线菌,其中两株对12种烟草病原真菌有拮抗作用;Kortemaa等[6]报道了世界上已广泛应用的一种放线菌的活体制剂防治腐霉菌、疫霉菌、镰刀菌和丝核菌等常见的土传病原菌;Loqman等[7]从摩洛哥葡萄根际土壤中分离获得142株放线菌,并测定了对尖孢镰刀菌、终极腐霉、大丽轮枝菌、灰葡萄孢菌及白绢病菌的拮抗作用,其中有24株放线菌至少抗4种病原菌。周喜新等[8]从湖南长沙浏阳市北盛镇烟草黑胫病发病田健株根际土壤中分离纯化获得1株对烟草疫霉具有显著拮抗作用的放线菌LY18,其发酵液对烟草疫霉菌丝的抑制率达70%;王静等[9]从山东省日照市五莲县于里镇烟田健株根际土壤分离纯化获得1株拮抗放线菌F8,室内测定对供试烟草疫霉具有较强的抑制作用,温室盆栽试验防效为70.3%。但河南省烟田土壤中拮抗放线菌种类及开发应用尚未见系统研究报道,为此,进行了洛阳地区烟草根围土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定,旨在为进一步开发利用拮抗微生物提供依据。1材料与方法1.1试验材料烟草疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)以及从烟草根围土壤分离的放线菌稀释涂布平板均由河南科技大学植物病害分子鉴定与绿色防控实验室保存。试验所用培养基包括:高氏一号琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、大豆酵母培养基、淀粉铵琼脂培养基、蔗糖察氏琼脂培养基、葡萄糖天门冬素琼脂培养基、克氏一号琼脂培养基和葡萄糖酵母膏琼脂培养基。细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(编号:B518255)和PCR扩增试剂盒(编号:B532491)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.2试验方法1.2.1根围放线菌的纯化将高氏一号培养基融化,待冷却至50℃左右,加入3%的重铬酸钾溶液使培养基中重铬酸钾浓度约100 mg/L,倒平板;待平板凝固后备用,用灭菌牙签从前期试验保存的稀释涂布平板上挑出菌落形态或颜色不同的放线菌单菌落至高氏一号平板上划线分离、纯化培养[10],直至获得单菌落。1.2.2拮抗菌株的筛选1.2.2.1拮抗菌株的初筛采用改良的平板对峙培养法[11]测定菌株对烟草疫霉的拮抗作用,保留抑菌率≥50%的菌株进行复选。1.2.2.2拮抗菌株的复筛采用菌丝生长速率法[12]测定初选菌株发酵液对烟草疫霉的抑菌活性,选取抑菌率达100%的菌株进一步鉴定其种类。1.2.3拮抗菌株的鉴定1.2.3.1形态及培养特征观察用插片法[13]在普通光学显微镜(无锡瀚光光学科技有限公司)100倍油镜下观察记载其基内菌丝体有无横隔、是否断裂;气生菌丝体的特征;孢子链的形状、着生方式;孢子的形状等。根据《链霉菌鉴定手册》[14],将菌株分别接种在高氏一号琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、淀粉铵琼脂培养基、蔗糖察氏琼脂培养基、葡萄糖天门冬素琼脂培养基、克氏一号琼脂培养基

参考文献

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