HSV-1感染细胞中HTRP基因的克隆及表达纯化

作者:刘龙丁;董承红;董少忠;王丽春;胡方;赵红玲;李琦涵 刊名:病毒学报 上传者:唐宏伟

【摘要】在对单纯疱疹病毒 1型 (HSV - 1)感染KMB - 17细胞后的早期基因反应的研究中 ,从HSV - 1感染后细胞特异性cDNA文库中筛选出一个 1381bp基因—HTRP ,基因测序分析表明为与HSV - 1感染相关基因 (GenBank登录号 :AF45 0 482 ) ,含有完整的ORF框架 ,cds全长 92 4bp ,编码 30 8个氨基酸。构建了 pGEX -HTRP表达质粒 ,在大肠杆菌BL2 1中获得了较高的表达 ,采用GlutathioneSepharose4B进行亲和纯化后获得较高纯度的HTRP蛋白。用该蛋白免疫小鼠后制备的特异抗血清 ,在蛋白印迹实验中表现出抗体的特异性。

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-1是严重危害人类健康、可引起多种疾病的常见病原体。它是一种结构复杂的双链病毒,其特殊的潜伏感染以及某些潜在的致癌特性,使之成为病毒学研究中的热点。病毒与细胞的相互作用呈现出多样性的特征,尤其是病毒感染的不同阶段刺激细胞产生的多种基因产物[1-3],为这种复杂现象提供了直接的实验基础和分析线索。在我们的前期工作中,已注意到-1结合人成纤维细胞-17株表面的受体之后,能够诱导细胞出现多种特异的基因反应[4],以差异显示[5]发现的差异片段作为探针进行筛选,已克隆到了一些新基因[6]。本文所描述的是一个新的未知功能基因的发现及其编码蛋白的表达和纯化,此蛋白和-1病毒感染之间的关系,以及它的生物学活性还有待进一步探索,以期为病毒与宿主相互作用的认识提供线索和进一步研究基础。材料与方法1细胞、病毒、菌株和质粒-17细胞、-2细胞为本所保存。-1型标准病毒株由本所保存、繁殖并收获于细胞,蔗糖密度梯度离心纯化,病毒滴度为10750/。菌株5、21、10及表达质粒-5-1为医学生物学研究所病毒免疫室保存。2主要试剂限制性内切酶、聚合酶、连接酶、修饰酶及蛋白酶为公司、公司产品。提取试剂盒、合成试剂盒、-4、因子为公司产品。[-32]-购自中国同位素公司。3-1型病毒刺激-17细胞后的文库的建立31病毒吸附细胞将-1型病毒接种于弃上清并经洗3次的单层细胞,4吸附1后转至371,刮下细胞,冷洗3次备用。32带有酶切位点的双链的制备采用公司提取上述细胞的,方法按试剂盒说明书。并以此为模板,使用合成试剂盒先逆转录合成第一条链,再制备成双链,并在两侧各加上一个位点的接头,纯化备用,方法按试剂盒使用说明书。33文库的建立将上述带有位点接头的双链重组入-19克隆载体中,转化到-5感受态细胞中,挑取白色菌落扩增培养,编号,于-2025%-甘油液保存备用。4病毒刺激前后的差异显示分析使用引物将经病毒结合1后的细胞及未结合的对照细胞逆转录,再使用引物及随机引物12做扩增,循环参数:955;941,421,721;40个循环。上样7%-7/尿素胶,1700,干胶后光片放射自显影。5狭缝印迹杂交筛选以所获得的特异性基因片段为模板[2],按常规使用[-32]-标记扩增的特异性片段为探针;扩增培养上述文库中的菌种,将小量提取的质粒80变性后点样于硝酸纤维素膜上,与探针42杂交过夜,2及02、01梯度洗35遍后,自显影于光片。6酶切及测序分析将斑点杂交结果为阳性及弱阳性的质粒,经酶切初步确定基因大小后,分别用正、反向通用引物从片段的两端进行测序分析。7差异基因的-确定以所获得的特异性基因阳性片段序列设计引物,对经病毒结合后细胞及未结合的对照细胞的进行-扩增,循环参数:945;9440,5640,7240;25个循环。8表达质粒的构建根据编码序列及-5-1读码框设计含限制酶酶切位点(斜体部分)引物1:5--3,2:5--3。以纯化的阳性质粒为模板进行扩增后克隆入-5-1中,获得含-融合基因的-质粒。9蛋白的表达和纯化将转化有表达质粒的21菌株活化后,以1100的比例接种于含有的新鲜液体培养基中,30培养至600达0406,以终浓度01/的诱导培养34,以4000/4离心15,收集菌体,悬浮。悬浮液中加入溶菌酶至终浓度05/及蛋白酶抑制剂至终浓度为01/,冰浴30;超声破碎细胞后加入-100至终浓度1%,12000/4离心15,收集上清液。依据操作说明进行-4亲合层析后,用-混合液1(100+900)在吸附柱中进行酶切5,500离心得到纯化蛋白。10抗体制备设实验组及对照组小鼠各5只,取纯化蛋白

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