Hira基因的过量表达对果蝇早期胚胎发育的影响

作者:王玉凤;徐艳菊 刊名:华中师范大学学报(自然科学版) 上传者:胡江涛

【摘要】H ir/H ira基因产物是组蛋白基因表达的一种负调节因子,其在果蝇发育过程中的作用还没有得到确认.本研究将果蝇H ira基因(dH ira)的cDNA克隆到载体UA SP中,运用UA S-G a l4系统使其在果蝇早期胚胎中大量表达.结果发现在胚胎发育早期,无论是在头部还是在全胚胎过量表达H ira,都引起果蝇胚胎大量死亡,而且随着转基因拷贝数的增加,胚胎的死亡率也显著增加,说明H ira过量表达对果蝇胚胎发育产生严重影响.由于H ira基因产物与核小体的组装、染色质结构等的调节有关,因此推测H ira过量表达可能是通过对组蛋白的抑制对果蝇胚胎发育造成影响的.

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Hir/Hira(histoneregulation,组蛋白调节基因)最先是在酵母中被鉴定出来的,它是组蛋白基因表达的一种负调节因子[1].HIRA包含一组保守的蛋白家族,广泛存在于从酵母、果蝇、鱼、爪蟾、鸡到哺乳动物小鼠和人类等多种生物体当中[2~8].众多证据表明,HIRA通过调节局部染色质的结构,从而影响到了DNA的合成以及细胞周期的进程,可能正是通过这些途径对生物体的基本发育过程(特别是早期胚胎发育)产生了重要的调节作用[5,7,9~11].HIRA的结构在从酵母到人类的长期进化过程中高度保守,说明它们可能在真核生物的组蛋白合成的调节方面也具有相似的功能.然而在高等真核生物中,发育过程更加复杂,因此HIRA除了调节组蛋白基因转录之外,也对早期胚胎发生过程具有特殊的调控作用.Kirov等和Llevadot等先后在果蝇中发现了HIRA家族的成员DHIRA[3,12].Northern分析表明,在雌性成体中、未受精卵和0~3时龄的胚胎中,杂交显示出很强的信号,之后杂交信号就变弱了,但在以后的发育阶段和雄性成体中都可以检测到.原位杂交显示,dHira转录本最早在卵子发生中期的营养细胞中被检测到,并且逐渐定位到发育中的卵母细胞中,转录本的量也逐渐增高.转录本在早期囊胚期维持很高的量,当发育至3h的时候急剧下降,说明这些转录本是母源性的,而且它们在早期胚胎发育过程中可能起了特别重要的作用.由于在整个胚胎发育期以及在幼虫阶段,细胞分裂都在持续进行,但在胚胎发育后期和幼虫阶段,dHira的转录本含量很少,意味着在高等生物中,HIRA的作用可能不仅仅在于将核小体组装到新复制的DNA上,可能它们还与发育过程中染色质结构的调节有关[12].为了进一步探讨Hira基因在果蝇胚胎发育过程中的作用,我们在果蝇发育早期,进行Hira的功能获得性突变,使该基因在胚胎发育早期过量表达,结果导致胚胎大量死亡.1材料与方法1.1质粒构建从含有果蝇HiracDNA的质粒(由美国N.Kirov博士友好提供)中,通过PCR的方法得到Hira基因的编码序列.为了进行克隆,PCR上游和下游引物都含有NotI内切酶位点序列.PCR产物被克隆进两种不同的载体,允许其在转基因果蝇中表达.(1)第一个载体是UASP,它能够允许基因在酵母蛋白Gal4的转录控制之下在卵子发生和早期胚胎发育过程中大量表达[13].PCR扩增片段用NotI酶切,再用磷酸酶处理后,插入UASP载体,用酶切的方式筛选正向的阳性克隆.(2)第二种载体是pnanos-Bcd3'UTR,它使得基因在卵子发生过程中转录,卵子一旦产出时就在胚胎前端表达母体蛋白[14].PCR扩增片段插入载体pnanos-Bcd3'UTR,从而得到pnanos-dHira-Bcd3'UTR质粒.从这个质粒上再切下含有Hira编码序列、nanos启动子和Bcd3'UTR的NotI-KpnI片段,插入含有P因子和white(+)基因的pCasper4质粒,用这种质粒进行转基因可得到稳定的转基因的后代.1.2转基因及果蝇遗传学选择白眼果蝇的胚胎进行注射,显微注射参照Bellaiche等[15].选择红眼的后代进行染色体平衡和插入子定位.用Gal4GCN4,NGT40(来自于Bloomintoncenter)和ActGal4/Cyo-PscGFP(转基因)雌体和UASP的转基因果蝇进行杂交来过量表达目的基因.1.3胚胎死亡率的统计选择刚孵化出来还为交配过的雌蝇,与不同品系的转基因雄蝇进行杂交,待果蝇处于产卵高峰期时,将父母本转入1个空的锥形瓶中,瓶底敲一个

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