Skp2参与HeLa细胞G_2/M周期检查点的调控

作者:钱俊杰;孙国敬;孟祥兵;宋宜;梅柱中;刘斌;董燕;孙志贤 刊名:中国生物化学与分子生物学报 上传者:景凯

【摘要】具癌基因特性的Skp2在大多数肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,它作为SCFSkp2复合物的底物识别亚基调控p27KIP蛋白的稳定性而促进细胞G1/S期转换.为进一步明确Skp2与G2/M周期检查点的关系,在HeLa细胞中过表达Skp2以及通过反义寡核苷酸抑制Skp2表达.结果发现:Skp2能促进细胞周期运转,表现为S期细胞增多和G2/M期细胞减少,其中F-box结构域具有重要的功能意义;反义寡核苷酸抑制Skp2表达后,HeLa细胞发生显著的G2/M期阻滞;MTT检测结果表明,400nmol/L的Skp2的反义寡核苷酸能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;Western印迹结果表明,HeLa细胞中Skp2可能通过负调控p21WAF的稳定性来参与G2/M检查点调控,这在用放线菌素D处理HeLa细胞的实验中得到验证.这些结果初步揭示了Skp2参与HeLa细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.

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Skp2(S-phasekinase-associatedprotein2)是1995年Zhang等[1]最初发现的细胞周期中S期激酶相关蛋白,它在多种实体瘤和白血病细胞中异常高表达,表现为癌基因特性.后来研究表明,细胞中Skp2可作为泛素-蛋白酶体通路(ubiquitinproteasomepathway)中E3连接酶-SCF复合物(Skp-cullin-F-boxproteincomplex)的底物识别亚基发挥其功能.作为与细胞周期相关的重要E3s酶的SCFSkp2复合物是由F-box蛋白Skp2和Skp1、Cul1与Roc1亚基组成.Skp2分子C端含有40个氨基酸左右的WD保守序列结构,介导与Skp1的相互作用,称为F-box结构:N端的一段底物识别序列,直接介导与底物结合,实现SCFSkp2复合物对降解底物的选择性[2].SCFSkp2复合物介导p27KIP、p21WAF、E2F1和Myb等周期相关蛋白的降解,参与细胞周期调控,并与肿瘤的发生、发展关系密切[3].研究发现,细胞内Skp2的表达水平直接反映细胞的增殖状态,肺小细胞癌细胞中SKP2基因在染色体水平上表现为高度扩增,导致细胞中高水平的Skp2蛋白表达,而使细胞恶性增殖;相反,借助Skp2的反义寡核苷酸抑制Skp2的表达,则能诱导肺小细胞癌细胞的周期阻滞或凋亡[4,5].以往研究表明,作为SCFSkp2复合物中的底物识别亚基,Skp2识别磷酸化的p27,使其通过泛素-蛋白酶体通路降解,从而释放了周期素依赖激酶cyclinE/CDK2复合物的活性,而使细胞通过R限制点,发生G1/S期的转换[6].但Skp2与细胞周期G2/M期的关系尚未见报道.Latres等[7]认为,p27并不是Skp2的唯一的下游靶分子,因为反义寡核苷酸处理的细胞中p27蛋白的表达水平并没有发生变化,有鉴于p21WAF既是SCFSkp2复合物的底物,又是细胞周期G2/M检查点调控的关键分子,而我们先前的研究结果也证明,Skp2的表达能够调控p21WAF的稳定性[8,9].因此,我们认为,Skp2极有可能通过负调控p21WAF来参与细胞G2/M检查点调控,从而导致细胞失去G2/M检查点的监控作用而使细胞恶性增殖.本文旨在通过HeLa细胞中过表达Skp2及其F-box缺失突变体或抑制Skp2的表达,用流式细胞术检测Skp2的表达水平与细胞周期的关系,Western印迹分析相关周期检查点蛋白的表达水平.研究证明,HeLa细胞中高表达的Skp2可能通过调节p21WAF的稳定性参与细胞中G2/M检查点调控,这在放线菌素D处理的HeLa细胞实验中得到验证.这些研究结果初步揭示了Skp2参与肿瘤细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.1材料与方法11材料111细胞系和菌株HeLa细胞和E.coliDH5菌株均由本实验室保存.112试剂RPMl1640,DMEM培养基购自Gibco公司;Skp2(H-435),p21(C-19),p27(C-19)抗体购自Santa公司;Myc抗体购自Clontech公司;Lipofectin和Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;BCAProteinAssayReagentKit和SupersignalWestPicoChemiluminescentSubstrate购自Pierce公司;proteaseinhibitorcocktailtablets购自Roche公司;其它试剂均为国产分析纯试剂.12方法121Skp2F-box突变体及plRES-GFP-Skp2

参考文献

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