几种离体动物细胞抗菌肽的诱导及抗菌活性的初步研究

作者:洪华珠;钟春英;叶雯;彭建新 刊名:华中师范大学学报(自然科学版) 上传者:王行雁

【摘要】分别选取几种离体培养的昆虫细胞、哺乳动物细胞和肿瘤细胞,用热灭活的大肠杆菌DH 5a诱导细胞产生抗菌肽,诱导的上清液经三氯乙酸沉淀提取诱导蛋白,采取抑菌圈法测定其抗菌活性.对从不同种细胞中诱导产生的抗菌肽的抗菌活性进行比较,发现5B 1、SF-9、V ero、293、PK-15和IBRS-2细胞均能产生抗菌活性物质,其中V ero细胞产生的抗菌肽活性最强.经T ric ine-SDS-PAGE、银染后发现,各种细胞产生的抗菌肽分子量为7 000左右.

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抗菌肽是生物进化过程中为适应环境,求得生存而最早产生的免疫活性分子,是动物体吞噬细胞和上皮细胞的主要杀菌分子,具有广泛的抗微生物活性和其它的重要生物学功能[1,2].自昆虫中发现抗菌肽以来,迄今已有700多种抗菌肽在生物体中被分离,其中在哺乳动物中和昆虫细胞中均已分离了上百种抗菌肽[3],而且新的抗菌肽还在不断的发现.但是已有的研究大多是集中在机体内或组织中进行的,而利用离体培养的细胞来研究生物的免疫性排除了生物体内复杂因素的影响,便于从分子水平上分析诱导的过程,因此具有更大的意义.本研究从多种离体培养的昆虫细胞和哺乳动物细胞中诱导产生抗菌肽,对其进行了抗菌活性的检测,并通过Tricine-SDS-PAGE对抗菌蛋白进行了初步分析.1材料和方法1.1细胞系和细胞培养供试细胞有脊椎动物细胞、无脊动物细胞和人类细胞(见表1).表1供试细胞系及其培养条件细胞系细胞来源培养基胰酶消化时间/min培养条件粉纹夜蛾卵细胞系美国康乃尔大学GranadosGrace辅以7%胎牛血清28(BTI-Tn-5B1,简称5B1)教授提供,本所保存草地贪夜蛾(SF-9)武汉大学提供Grace辅以7%胎牛血清28仔猪肾上皮细胞系(IBRS-2)华中农业大学提供DMEM辅以10%小牛血清2~337,5%CO2仔猪肾上皮细胞系(PK-15)华中农业大学提供DMEM辅以10%小牛血清2~337,5%CO2猪肺泡巨噬细胞系(Marc-145)华中农业大学提供DMEM辅以10%小牛血清5~637,5%CO2乳仓鼠肾上皮细胞系(BHK-21)华中农业大学提供DMEM辅以10%小牛血清2~337,5%CO2非洲绿猴肾细胞系(Vero)武汉病毒所提供DMEM辅以10%小牛血清2~337,5%CO2人胚胎肾上皮细胞系(293)武汉病毒所提供DMEM辅以10%小牛血清37,5%CO2人子宫颈癌细胞系(Hela)武汉病毒所提供1640辅以10%小牛血清3~437,5%CO2人肝癌细胞系(SMMC-7721)华中师范大学提供1640辅以10%小牛血清3~437,5%CO21.2抗菌物质的诱导参照文献[4]的方法进行.1.2.1诱导物的制备大肠杆菌DH5a以LB培养基在37摇床扩大培养1d,收集培养物,2000r/min离心10min,弃上清,沉淀用PBS洗2次,然后120高压灭菌20min,4保存备用.1.2.2诱导方法将处于对数生长期的细胞从细胞瓶上刮下(哺乳动物细胞需加胰酶消化),加入新鲜的培养基,稀释至3105细胞/mL,过夜培养,第2天除去旧培养基,再用PBS洗2次,加入无血清的Grace或DMEM基础培养基,并以每个细胞1000个大肠杆菌的比例加入上述灭活备用的大肠杆菌,诱导细胞产生抗菌肽,并观察细胞的生长和溶菌过程.1.3抗菌活性物质的提取收集细胞培养物上清液,以10000r/min,4离心10min,收集上清,加入TCA至终浓度为10%,冰浴10min,以10000r/min,4离心10min,弃上清,沉淀用91的丙酮:水洗涤,转入enpendof管中,14000r/min离心15min,沉淀物真空冷冻干燥保存备用.1.4抗菌活性物质的活性检测1.4.1比浊法将提取的细胞上清沸水浴10min,10000r/min离心10min,上清以0.45m滤膜抽滤,取0.8mL滤液于enpendof管中,加入对数生长期的大肠杆菌抗氨苄菌株K12D3120uL,加氨苄青霉素至终浓度50g/mL,150r/min,37恒温培养3~4h至细菌生长至对数生长期,取出冰浴10min,用核酸蛋白仪测定OD6

参考文献

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